【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞學，具體涉及一種長距離運輸牦牛卵巢、卵母細胞的方法及卵母細胞長途運輸路上成熟培養體系。
技術介紹
1、牦牛是青藏高原特有的畜種資源，又被稱為萬能家畜，素有“高原之舟”之稱，其肉、奶不僅是高原地區的主要食物來源，其糞便、皮毛也是牧區主要的取暖和保暖材料，是高寒牧區重要的經濟基礎和支柱產業。卵母細胞的體外成熟、體外胚胎生產以及胚胎移植是保存和傳遞優質種質資源的重要環節，采用合適的方法保存、運輸牦牛卵巢和卵母細胞對于更好的收集和利用寶貴的青藏高原畜牧資源尤為重要。
2、由于從活體內收集到的卵母細胞數量有限，目前胚胎工程實驗所需的卵母細胞均從屠宰場屠宰動物后的離體卵巢中收集，在1～2h內盡快送到實驗室處理。而動物屠宰場一般遠離城區，地處偏遠鄉縣，交通多有不便，因此在實際生產中，受到運輸距離、方式和溫度等影響，最終從卵巢中采集的卵母細胞質量也會受到影響，而卵母細胞的質量直接影響后續胚胎發育。先前研究表明，卵巢運輸時間過長會影響卵母細胞的質量，抑制蛋白質的合成并抑制生發泡破裂的發生，顯著降低卵母細胞的體外成熟率，而卵母細胞的體外成熟是體外受精和體外胚胎發育的基礎，其成熟情況是決定卵裂率及后續囊胚發育率高低的關鍵。因此卵巢的運輸時間和保存溫度均會對體外胚胎發育產生影響。牦牛生活區地處高原，交通更為不便，從屠宰場向實驗室運輸卵巢需要更長的時間，極大限制了對于牦牛卵巢資源的研究與利用。若能找到合適的方法保存、運輸牦牛卵巢對于更好的收集和利用牦牛卵母細胞、提升后續胚胎發育的質量有重要意義。
3、目前，采集到
4、其次，長途運輸成本高昂，加之牦牛種質資源的稀少珍貴，如何最大化牦牛卵巢的回收效率以及是否能夠實現牦牛卵母細胞在運輸過程中實現體外成熟也是亟待解決的問題。一般卵母細胞的獲取首先是從卵泡液中抽取的卵丘-卵母細胞復合體(cocs),目前關于cocs的質量評定一般從鏡下形態分類：卵丘細胞三層以上、細胞質均勻且結構致密的cocs定為a級；卵丘細胞1-3層的cocs定為b級；裸卵及胞質形態差的cocs定為c級。關于牦牛卵母細胞成熟率的研究一般也圍繞三種cocs比較成熟，而鏡下卵丘細胞已開始擴散的cocs(ex-cocs)通常被舍棄，鮮有研究。如果ex-cocs也可長途運輸體外成熟，則可大幅提高牦牛卵巢的回收效率和卵母細胞的體外成熟效率。
5、那么如果能解決上述問題，實現牦牛卵巢長時運輸保存和建立牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟體系，將距離短板變為科學研究的橋梁，實現牦牛卵巢和卵母細胞全國范圍輸送，對于提升牦牛卵母細胞的成熟效率，提升科研效率，節約科研成本，更好地開發利用青藏高原寶貴的牦牛種質資源有重大意義。
技術實現思路
1、為克服相關技術和實驗室距離存在的問題，本專利技術提供了一種便捷的牦牛卵巢長途運輸保存方法以及牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟培養體系。
2、本專利技術的目的在于通過確定長途運輸過程中牦牛卵巢的最適保存溫度，研究兩種卵丘-卵母細胞復合體(cp-cocs；ex-cocs)的成熟效率，來提高卵母細胞的回收率，同時利用便攜式恒溫培養箱建立牦牛卵母細胞長途運輸管中體外成熟體系，減少長時運輸對于牦牛體外胚胎的發育潛能影響。
3、為了實現上述專利技術，本專利技術采用如下技術方案，一種西藏牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟方法，其特征在于，包括以下步驟：
4、(1)確定牦牛卵巢的長途運輸最佳保存溫度：從屠宰場收集的離體卵巢采用不同保存溫度的卵巢保存液運輸至距離交通樞紐站最近的實驗室，抽取牦牛卵巢上表面直徑3-8mm間的卵泡液，用撿卵液稀釋后置于鏡下挑選有2～3層以上gcs包裹的卵丘-卵母細胞復合體(cocs)。根據卵母細胞表層的gcs擴散形態將收集的卵母細胞分為擴散形狀為松散狀的擴展型卵母細胞(ex-cocs)以及擴散狀態為緊縮狀的緊湊型卵母細胞(cp-cocs)。經洗卵液和成熟液清洗后，統計回收效率。獲取牦牛卵巢不同運輸保存溫度對cocs的回收效率的差異，基于結果明確不同溫度運輸對cocs回收效率的影響。
5、(2)卵母細胞的長途運輸體外成熟：將步驟(1)得到的cp-cocs和ex-cocs清洗后分組置于裝有提前制備好的成熟管中，密封嚴實后置于便攜式恒溫培養箱中培養。培養箱溫度設為38.5℃。
6、(3)統計卵母細胞成熟效率：通過對收集到的cp-cocs和ex-cocs在便攜式恒溫培養箱中的長途運輸成熟效率進行測定，以實驗室往期短途運輸(2h內)奶牛卵母細胞體外成熟效率數據進行比較分析，同時對成熟效率較高且沒有顯著差異的組別挑選優質成熟卵母細胞進行孤雌激活(pa)，來進一步驗證本專利技術培養體系對于牦牛后續胚胎發育的影響。
7、進一步的，步驟(1)中，確定牦牛卵巢的長途運輸最佳保存溫度包括如下步驟：
8、1.1卵巢的收集：從屠宰場收集的剛屠宰完離體的牦牛卵巢，立刻置于不同溫度的生理鹽水保溫杯里，不同的保存溫度運輸包括：在4℃、室溫、20℃、25℃、30℃、38℃；
9、1.2卵巢的長途運輸：收集好的卵巢出廠運輸前，用不同溫度的生理鹽水清洗2-3次，置于對應溫度的卵巢保存液的保溫杯中運輸，確保杯中溫度恒定在運輸溫度。
10、1.3卵母細胞的回收：卵巢抵達采卵實驗室后，用30℃的生理鹽水清洗2-3次，至洗不出血水為止。洗過的卵巢放入盛有生理鹽水的燒杯中，燒杯置于熱臺上。用一次性無菌擦手紙擦干卵巢表面水分，使用規格為10ml的一次性注射器抽取直徑為3-8mm卵泡中的卵泡液。將抽取的卵泡液添加適量的洗卵液搖勻后轉移到60mm玻璃皿，在體視顯微鏡下撿出卵丘包裹完整且形態良好的cocs，經洗卵液清洗3次，洗去雜質后，再用卵母細胞成熟培養液清洗2次。據卵丘細胞的擴散程度，將清洗好的cocs鏡下分揀為緊湊型和擴散型，統計回收率。
11、進一步的，所述步驟(2)中，卵母細胞的長途運輸體外成熟包括如下步驟：
12、2.1卵母細胞成熟液的制備：準備5ml圓底玻璃離心管，將配制好的成熟液分裝4ml至離心管中，離心管管口敞開置于38.5℃、5％體積的co2和最大飽和濕度的培養箱內平衡后10-15h小時，密封好置于-20℃保存。
13、2.2利用便攜式培養箱進行卵母細胞體外成熟：鏡下分揀好的cp-cocs和ex-cocs，分組轉移到管裝成熟液中，管壁標記好緊湊型和擴展型以及細胞個數，密封嚴實后置于便攜式恒溫培養箱中培養，培養箱溫度設為38.5℃。
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【技術保護點】
1.一種牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟方法，其特征在于包括如下步驟：
2.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于，所述步驟(2)在運輸過程中：保溫杯需要置于泡沫保溫箱中，外面包裹簡易保溫材料，長距離運輸3～4小時后，更換一次生理鹽水，確保杯中溫度恒定在30℃。
3.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述步驟(4)的所述洗卵液是由含有5％胎牛血清的杜氏磷酸緩沖液DPBS。
4.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述成熟液包括TCM199基礎培養液、胎牛血清FBS、卵泡刺激素FSH、促黃體生成激素LH、雌二醇E2、表皮生長因子EGF、半胱氨酸、丙酮酸鈉和雙抗(青鏈霉素)；成熟液中，TCM199基礎培養液與胎牛血清FBS體積比為10：1；TCM199基礎培養液與雙抗的體積比為100:1。所述成熟液中，卵泡刺激素FSH的濃度為5-10μg/mL；促黃體生成激素LH濃度5-10μg/mL，雌二醇E2濃度為1μg/mL，表皮生長因子EGF濃度100ng
5.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述步驟(4)中的成熟管為5mL圓底玻璃離心管，內置成熟液的體積為4mL。
6.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟方法，其特征在于，所述步驟(4)中提前制備好的成熟管的制備方法為：
7.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于，所述步驟(4)中每支成熟管中放置80-100個卵母細胞。
8.根據權利要求1-7任意一項所述的牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于，所述方法適用于任何一種以最適溫度保存并需要長途運輸的哺乳動物卵巢及卵母細胞。
9.根據權利要求1-7中任意一項所述的牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于，所述方法適用于汽車、火車、高鐵、飛機等任意一種長距離交通運輸方式的卵母細胞體外成熟培養。
10.一種牦牛卵母細胞培養成熟液，所述成熟液包括TCM199基礎培養液、胎牛血清FBS、卵泡刺激素FSH、促黃體生成激素LH、雌二醇E2、表皮生長因子EGF、半胱氨酸、丙酮酸鈉和雙抗(青鏈霉素)；成熟液中，TCM199基礎培養液與胎牛血清FBS體積比為10：1；TCM199基礎培養液與雙抗的體積比為100:1。所述成熟液中，卵泡刺激素FSH的濃度為5-10μg/mL；促黃體生成激素LH濃度5-10μg/mL，雌二醇E2濃度為1μg/mL，表皮生長因子EGF濃度100ng/mL，半胱氨酸的濃度為0.05-0.1mg/mL，丙酮酸鈉的濃度為0.04-0.05mg/mL。
...【技術特征摘要】
1.一種牦牛卵母細胞長途運輸體外成熟方法，其特征在于包括如下步驟：
2.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于，所述步驟(2)在運輸過程中：保溫杯需要置于泡沫保溫箱中，外面包裹簡易保溫材料，長距離運輸3～4小時后，更換一次生理鹽水，確保杯中溫度恒定在30℃。
3.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述步驟(4)的所述洗卵液是由含有5％胎牛血清的杜氏磷酸緩沖液dpbs。
4.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述成熟液包括tcm199基礎培養液、胎牛血清fbs、卵泡刺激素fsh、促黃體生成激素lh、雌二醇e2、表皮生長因子egf、半胱氨酸、丙酮酸鈉和雙抗(青鏈霉素)；成熟液中，tcm199基礎培養液與胎牛血清fbs體積比為10：1；tcm199基礎培養液與雙抗的體積比為100:1。所述成熟液中，卵泡刺激素fsh的濃度為5-10μg/ml；促黃體生成激素lh濃度5-10μg/ml，雌二醇e2濃度為1μg/ml，表皮生長因子egf濃度100ng/ml，半胱氨酸的濃度為0.05-0.1mg/ml，丙酮酸鈉的濃度為0.04-0.05mg/ml。
5.根據權利要求1中所述的一種牦牛卵母細胞長時運輸體外成熟方法，其特征在于：所述步驟(4)中的成熟管為5ml圓底玻璃離心管，內置成熟液的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：萬秋紅，杜焓瑜，方盛國，朱曉寅，謝佳艾，雷鳴，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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