【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于納米復(fù)合材料制備及分析檢測，具體涉及一種功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠及其檢測β-分泌酶的方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、隨著我國老齡化進程的加劇，老年人群中發(fā)病率高、危害大的阿爾茨海默病（ad）已嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康。ad主要病理特征是患者腦部β-淀粉樣蛋白（aβ）沉積形成淀粉樣斑塊。β-分泌酶(bace1)可切割淀粉樣蛋白前體蛋白(app)生成aβ，是aβ生成的限速酶，故而bace1一直被認為是治療ad的重要靶點。此外，最近眾多研究還表明bace1在機體代謝、血管功能和免疫功能異常中發(fā)揮重要作用，異常升高的bace1可直接或間接地加速機體衰老以及促進衰老相關(guān)疾病（如心腦血管疾病、糖尿病以及癌癥等）的發(fā)展，因此，β-分泌酶活性監(jiān)測以及其抑制劑篩選在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。
2、目前，β-分泌酶活性檢測及其抑制劑篩選的方法主要有酶聯(lián)免疫法（elisa）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）探針法。elisa法和fret探針法雖然有效，但在實際應(yīng)用中均存在一定的困境，elisa法存在抗體價格昂貴、重復(fù)性差、操作繁瑣及分析周期長等缺點，而fret探針法則由于一些容易標(biāo)記的熒光基團的激發(fā)波長往往與許多藥物小分子的吸收波長重合，從而導(dǎo)致fret探針的熒光供體和受體的選擇要求較高，限制了其在抑制劑篩選領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，為了滿足實際應(yīng)用的需求，迫切需要發(fā)展通用性強、靈敏度高、簡單快速檢測β-分泌酶活性的新方法。
3、磁性納米生物材料是一種具有多種功能的納米材料，既具有納米材料的特性，如小粒徑、大比表面積，又具
4、基于上述論述，本專利技術(shù)針對β-分泌酶，制備了一種功能多肽修飾的復(fù)合納米磁珠，該納米磁珠能夠快速、靈敏檢測的檢測β-分泌酶，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值和重要的研究意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的目的是提供一種功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠，所述納米復(fù)合磁珠的化學(xué)組成為：以四氧化三鐵納米團簇作為磁核，磁核表面包覆二氧化硅殼層，殼層表面連接有乙二胺四乙酸修飾層，修飾層上螯合有金屬離子co2+或ni2+，熒光素cy5標(biāo)記的功能多肽與金屬離子co2+或ni2+偶聯(lián)負載在納米復(fù)合磁珠的表面；所述熒光素cy5標(biāo)記功能多肽的氨基酸序列為：
2、①?cys-gly-gly-ser-ser-glu-val-asn-leu-asp-ala-glu-phe-ser-ser-gly-leu-his-his-his-his-his-his；（seq?id?no.1）
3、②?lys-thr-glu-glu-ile-ser-glu-val-asn-leu-asp-ala-glu-phe-arg-his-asp-lys-cys-his-his-his-his-his-his；(seq?id?no.2)
4、③?cys-leu-gly-gly-glu-val-asn-leu-asp-ala-glu-phe-gly-gly-leu-his-his-his-his-his-his；（seq?id?no.3）
5、④[(his-his-his-his-his-his)4lys]-gly-gly-pro-pro-pro-pro-pro-pro-pro-pro-pro-?gly-glu-val-asn-leu-asp-ala-glu-phe-asp-asp-lys-gly-gly-asp-asp-asp-nh2（seq?id?no.4）中的任一所示。
6、本專利技術(shù)的第二目的是提供所述的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠的制備方法，包括如下步驟：
7、（1）溶劑法制備四氧化三鐵納米團簇；
8、（2）以步驟（1）制備得到的四氧化三鐵納米團簇為磁核，采用超聲波輔助溶膠-凝膠法制備二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇顆粒；
9、（3）將步驟（2）制備得到的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇顆粒分散在甲醇中，再分別加入冰乙酸和n-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽形成混合溶液，其中冰乙酸和n-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽的質(zhì)量比為1:2?~?1:10，在功率為150~300?w的超聲波輔助下進行反應(yīng)1~3?h，待反應(yīng)完成后用丙酮和去離子水清洗，得到edta修飾的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇；
10、（4）取步驟（3）制備得到的edta修飾的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇的超聲分散在水中，再加入nicl2或cocl2的水溶液，其中edta修飾的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇與?nicl2或cocl2的質(zhì)量比為1:?10?~?1:?100，混合溶液反應(yīng)1.5?~?3?h后，用去離子水清洗3次，即得到金屬離子ni2+或co2+螯合納米磁珠；
11、（5）將步驟（4）制備得到的金屬離子螯合納米磁珠分散在pbs溶液中，加入濃度為5~?15?μmol/l的功能多肽水溶液，37?℃下孵育反應(yīng)，磁分離納米磁珠；用?pbs溶液將納米磁珠洗滌3~5次，至洗滌液的熒光強度趨于零，所得磁珠即為功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠。
12、優(yōu)選的，步驟（1）所述的溶劑法制備四氧化三鐵納米團簇具體步驟如下：
13、先稱取三氯化鐵先溶于乙二醇中，再加入乙酸鈉和去離子水，攪拌至完全溶解后形成混合溶液，其中三氯化鐵、乙酸鈉和去離子水的質(zhì)量比為1?:?3?:?1，將混合溶液加入反應(yīng)釜中，設(shè)置程序先加熱至140?~?170?℃保溫1.5?~3?h，再升溫至180?~?220?℃保溫2?~8?h，整個反應(yīng)過程中的壓力為0.01?~?0.1?pa，反應(yīng)完成后，取出反應(yīng)釜中的沉淀物用丙酮和無水乙醇分別清洗，即得到四氧化三鐵納米團簇。
14、優(yōu)選的，步驟（2）所述的超聲波輔助溶膠-凝膠法制備二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇顆粒具體步驟如下：
15、先取一定量四氧化三鐵納米團簇顆粒，加入體積比為1?:?5?~?4?:?5去離子水和無水乙醇的混合溶劑，超聲分散均勻；再在冰水浴環(huán)境中加入濃氨水和正硅酸四乙酯，其中正硅酸四乙酯和濃氨水體積比為1?:?10?~?1:?20，在180?~?360?w功率條件下超聲反應(yīng)20~?60?min，待反應(yīng)完成后，用無水乙醇和去離子水分別清洗兩次，即得到二氧化硅包覆的四氧化三鐵納米團簇顆粒。
16、本專利技術(shù)的第三目的是提供一種非診斷目的的利用所述的功能多肽修飾納米復(fù)合磁珠檢測β-分泌酶的方法，所述的方法包括如下步驟：
17、（1）建立β-分泌酶檢測的標(biāo)準(zhǔn)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠，其特征在于，所述納米復(fù)合磁珠的化學(xué)組成為：以四氧化三鐵納米團簇作為磁核，磁核表面包覆二氧化硅殼層，殼層表面連接有乙二胺四乙酸修飾層，修飾層上螯合有金屬離子Co2+或Ni2+，熒光素Cy5標(biāo)記的功能多肽與金屬離子Co2+或Ni2+偶聯(lián)負載在納米復(fù)合磁珠的表面；所述熒光素Cy5標(biāo)記功能多肽的氨基酸序列為：
2.如權(quán)利要求1所述的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）所述的溶劑法制備四氧化三鐵納米團簇具體步驟如下：
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述的超聲波輔助溶膠-凝膠法制備二氧化硅包覆四氧化三鐵納米團簇顆粒具體步驟如下：
5.一種非診斷目的的利用權(quán)利要求1所述的功能多肽修飾納米復(fù)合磁珠檢測β-分泌酶的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1）中所述乙酸-乙酸鈉的緩沖溶液的濃度為20?mmol/L，pH為?4.5?~?6.0，功能多肽
7.如權(quán)利要求1所述的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠或通過權(quán)利要求2-4任一項所述的制備方法制備得到的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠在非診斷目的的檢測β-分泌酶中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1所述的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠在篩選β-分泌酶抑制劑中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠，其特征在于，所述納米復(fù)合磁珠的化學(xué)組成為：以四氧化三鐵納米團簇作為磁核，磁核表面包覆二氧化硅殼層，殼層表面連接有乙二胺四乙酸修飾層，修飾層上螯合有金屬離子co2+或ni2+，熒光素cy5標(biāo)記的功能多肽與金屬離子co2+或ni2+偶聯(lián)負載在納米復(fù)合磁珠的表面；所述熒光素cy5標(biāo)記功能多肽的氨基酸序列為：
2.如權(quán)利要求1所述的功能多肽修飾的納米復(fù)合磁珠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）所述的溶劑法制備四氧化三鐵納米團簇具體步驟如下：
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述的超聲波輔助溶膠-凝膠法制備二氧化硅包覆四氧化三鐵...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：左顯維，王焱，馮治棋，康春楊，劉春燕，高曉平，劉一丹，李昕，何欣，
申請(專利權(quán))人：甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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