【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥檢測的，具體涉及測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法。
技術介紹
1、醋酸地非法林是一種具有外周限制性和選擇性的kappa阿片受體激動劑，主要用于治療血液透析成人患者因慢性腎病（ckd）引發的中度至重度瘙癢。它通過特異性地激活kappa阿片受體，有效降低尿毒癥性瘙癢的強度，進而提升患者的生活質量。作為原料藥，醋酸地非法林的質量控制至關重要。
2、氨基酸比值作為多肽類藥物質量控制的重要指標，能夠反映藥物的氨基酸組成，從而間接驗證氨基酸序列的正確性。醋酸地非法林是通過固相合成法制備的，該過程依次按照預定的多肽序列進行氨基酸縮合，隨后進行裂解、純化、轉鹽及凍干。在其生產過程中，主要使用了d-賴氨酸、d-亮氨酸和d-苯丙氨酸這三種氨基酸。
3、然而，目前各國藥典和相關文獻中均未記載醋酸地非法林的質量標準。因此，開發一種準確且快速的氨基酸比值測定方法，對于確保醋酸地非法林原料藥的質量具有重要意義。
4、中國藥典2020版二部中，胸腺五肽的氨基酸比值測定方法存在一些問題。該方法要求取適量樣品，加入鹽酸溶液（1→2）后在110℃下水解24h，再采用適當的氨基酸分析方法進行測定。但該方法未明確說明衍生方法和具體的分析方法，且樣品經鹽酸溶液水解后酸性過強，可能對色譜柱造成嚴重損傷，同時水解時間過長。
5、另外，復方氨基酸注射液（18aa-iii）的氨基酸測定方法采用了十八烷基硅烷鍵合硅膠填充的色譜柱，該注射液樣品無需進行水解，直接衍生后在梯度洗脫條件下進行檢測，但洗脫時間長達60mi
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，樣品溶液水解時間短，水解后調ph至中性，減少了柱損傷；各氨基酸之間分離度好，靈敏度高、重現性好，運行時間短，可以準確測定醋酸地非法林中氨基酸比值。
2、本專利技術所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，包括以下步驟：
3、（1）溶液制備
4、a、稱取醋酸地非法林樣品適量，加酸水解后調ph至近中性，加入內標溶液，制成供試品溶液；
5、b、取d-賴氨酸鹽對照品、d-亮氨酸對照品、d-苯丙氨酸對照品，加入內標溶液，制成對照品溶液；
6、（2）測定
7、分別取空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，進行相同的衍生處理，取衍生后的溶液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內標法，以峰面積計算d-賴氨酸、d-亮氨酸、d-苯丙氨酸的比值；
8、所述的衍生處理具體步驟為：分別向空白溶液、供試品溶液、對照品溶液中加入三乙胺乙腈溶液，再加入異硫氰酸苯酯乙腈溶液，水浴反應，結束后放至室溫，加入正己烷，搖勻，放置至澄清，取澄清的下層液作為衍生后的溶液。
9、所述的色譜條件包括：
10、檢測器：pda或紫外檢測器；
11、色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為shimadzu?shimnex?hec18-aq，規格為4.6mm×250mm，5μm，或inersustain?aq-c18，規格為4.6mm×250mm，5μm；
12、檢測波長：245nm-254nm；
13、柱溫：25-35℃；
14、流動相：以乙酸鹽緩沖溶液-乙腈混合溶液為流動相a，以乙腈-水混合溶液為流動相b；所述的乙酸鹽緩沖溶液的制備方法為稱取乙酸鈉3.28-4.92g，加水溶解并稀釋，用醋酸調節ph值6.3-6.7。
15、洗脫方式：梯度洗脫，如表1所示，表1中%為體積百分比。
16、表1洗脫程序
17、
18、流速：0.9-1.1ml/min。
19、所述的乙酸鹽緩沖溶液為乙酸溶液，濃度為0.04-0.06mol/l，ph為6.3-6.7；所述的流動相a中乙酸鹽緩沖溶液與乙腈的體積比為94:6-92:8，流動相b中乙腈與水的體積比為78:22-82:18。
20、所述的內標溶液是稱取d-正亮氨酸適量，加水溶解并稀釋制成d-正亮氨酸濃度為40μg/ml的內標溶液。
21、所述的對照品溶液中，d-賴氨酸、d-亮氨酸的比值分別為0.8-1.2，d-苯丙氨酸的比值為1.6-2.4。
22、所述的對照品溶液是稱取d-賴氨酸鹽對照品、d-亮氨酸對照品、d-苯丙氨酸對照品各適量，置同一量瓶中，加入內標溶液，加水溶解并稀釋制成對照品溶液，對照品溶液中d-賴氨酸、d-亮氨酸和d-正亮氨酸的濃度為40μg/ml，d-苯丙氨酸的濃度為96μg/ml。
23、所述的各個氨基酸的計算方式如下所示：
24、所述的d-賴氨酸比值=d-賴氨酸摩爾數÷【（d-賴氨酸摩爾數+d-亮氨酸摩爾數+d-苯丙氨酸摩爾數）÷4】；所述的d-亮氨酸比值=d-亮氨酸摩爾數÷【（d-賴氨酸摩爾數+d-亮氨酸摩爾數+d-苯丙氨酸摩爾數）÷4】；所述的d-苯丙氨酸比值=d-苯丙氨酸摩爾數÷【（d-賴氨酸摩爾數+d-亮氨酸摩爾數+d-苯丙氨酸摩爾數）÷4】。
25、所述的供試品溶液是將醋酸地非法林樣品加入鹽酸溶液在105-115℃水解11-13h，放至室溫，調節ph為6.0-8.0，加入內標溶液，加水稀釋，制成醋酸地非法林濃度為0.2mg/ml的供試品溶液。
26、在衍生處理中，異硫氰酸苯酯乙腈溶液是將異硫氰酸苯酯溶于乙腈，濃度為0.1mol/l-1mol/l；三乙胺乙腈溶液是將三乙胺溶于乙腈，濃度為0.1mol/l-1mol/l，水浴反應溫度為40℃-50℃，水浴反應時間為30min-35min。
27、所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與三乙胺乙腈溶液的體積比為2:1；所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1；所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與正己烷的體積比為2:1。
28、所述的空白溶液為水。
29、所述的步驟（2）中分別取空白溶液水、供試品溶液、對照品溶液各2ml，分別置具塞試管中，精密加入1ml的1mol/l三乙胺乙腈溶液，1ml的0.1mol/l異硫氰酸苯酯乙腈溶液，搖勻，45℃水浴中反應35min，取出放冷，再分別精密加入1ml正己烷，搖勻，放置溶液至澄清，取澄清的下層液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
30、與現有技術相比，本專利技術具有的有益效果是：
31、（1）本專利技術的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，樣品水解時間短，水解結束后將溶液ph調至中性再進樣分析，減少了對色譜柱的傷害。
32、（2）本專利技術的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，設置梯度洗脫程序，洗脫時間短，衍生空白不干擾各氨基酸出峰，專屬性強。
33、（3）本專利技術的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，各氨基酸之間分離本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的色譜條件包括：
3.根據權利要求2所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的梯度洗脫程序為：在第0min，流動相A為80%，流動相B為20%；在第5min，流動相A為80%，流動相B為20%；在第20min，流動相A為65%，流動相B為35%；在第21min，流動相A為0%，流動相B為100%；在第26min，流動相A為0%，流動相B為100%；在第27min，流動相A為80%，流動相B為20%；在第35min，流動相A為80%，流動相B為20%。
4.根據權利要求2所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的乙酸鹽緩沖溶液為乙酸鈉溶液，濃度為0.04-0.06mol/L，pH為6.3-6.7；
5.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的內標溶液是取D-正亮氨酸加水溶解后得到的溶液。
6.根據權利要求1所
7.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的供試品溶液是將醋酸地非法林樣品加入鹽酸溶液在105-115℃水解11-13h，放至室溫，調節pH為6.0-8.0，加入內標溶液，加水稀釋，制成供試品溶液。
8.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：在衍生處理中，異硫氰酸苯酯乙腈溶液是將異硫氰酸苯酯溶于乙腈，濃度為0.1mol/L-1mol/L；三乙胺乙腈溶液是將三乙胺溶于乙腈，濃度為0.1mol/L-1mol/L，水浴反應溫度為40℃-50℃，水浴反應時間為30min-35min。
9.根據權利要求8所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與三乙胺乙腈溶液的體積比為2:1；所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1；所述的空白溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別與正己烷的體積比為2:1。
10.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的空白溶液為水。
...【技術特征摘要】
1.一種測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的色譜條件包括：
3.根據權利要求2所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的梯度洗脫程序為：在第0min，流動相a為80%，流動相b為20%；在第5min，流動相a為80%，流動相b為20%；在第20min，流動相a為65%，流動相b為35%；在第21min，流動相a為0%，流動相b為100%；在第26min，流動相a為0%，流動相b為100%；在第27min，流動相a為80%，流動相b為20%；在第35min，流動相a為80%，流動相b為20%。
4.根據權利要求2所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的乙酸鹽緩沖溶液為乙酸鈉溶液，濃度為0.04-0.06mol/l，ph為6.3-6.7；
5.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的內標溶液是取d-正亮氨酸加水溶解后得到的溶液。
6.根據權利要求1所述的測定醋酸地非法林的氨基酸比值的方法，其特征在于：所述的對照品溶液中，d-賴氨...
【專利技術屬性】
技術研發人員：董旭，辛曉倩，劉印，任文剛，楊學謙，宋文姬，王學習，任繼波，李宗濤，時磊，
申請(專利權)人：山東齊都藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：
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