【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物合成，特別涉及一種生物酶法合成nadph的方法。
技術(shù)介紹
1、生物催化利用酶作為催化劑，具有高效性、產(chǎn)物專一性等特征，被廣泛應(yīng)用于手性藥物及其中間體合成。然而，大部分酶還原過程需等摩爾量的還原態(tài)輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或其磷酸化形式(nadph)作為氫源，輔酶價格昂貴。目前nadph的合成主要通過生物法或化學(xué)法進行。
2、目前相關(guān)研究報道的nadph主流合成方法以生物法為主，主要是研究在細胞內(nèi)代謝合成反應(yīng)過程中nadph的再生系統(tǒng)以及相關(guān)技術(shù)和工藝。極少涉及nadph的生產(chǎn)工藝。目前工業(yè)應(yīng)用和研究最多的常規(guī)合成路線是以nad+為起始物料，先轉(zhuǎn)化成nadp+，再轉(zhuǎn)化為nadph的路線。一方面，nad+的成本較高，一般可達到幾千元/kg，另一方面，該路線的產(chǎn)率不是很理想，一般只有20％左右。
3、nadph的化學(xué)法合成主要是更換為無機催化劑進行催化生產(chǎn)，依然還是按照輔酶循環(huán)再生的思路進行設(shè)計，如專利cn117816244a中開發(fā)了一種負載型金屬納米粒子催化劑，可以將nadp+轉(zhuǎn)化為nadph。
4、目前無論是生物制備方法還是化學(xué)制備方法，整體的思路依然還是局限在細胞內(nèi)nadph濃度的強化和提升、nadph的循環(huán)再生的強化以及nadph的細胞內(nèi)生產(chǎn)和細胞內(nèi)利用，由于細胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)無時無刻在發(fā)生成千上萬的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致nadph的含量或濃度始終處于一個動態(tài)的平衡中，嚴重限制了nadph的提取效率，所得產(chǎn)率往往極低，再加上后續(xù)分離純化也較為困難，在制備過程中存在很高的損
5、化學(xué)制備方法的思路僅僅是更換了無機催化劑，應(yīng)用于nadp+和nadph之間的相互轉(zhuǎn)化，無法拓展為nadph的單一生產(chǎn)，由于nadp+價格較高，因此該方法無法生產(chǎn)具有商業(yè)價值的高性價比nadph產(chǎn)品。
6、綜合目前的nadph制備方法，亟需開發(fā)一條起始物料廉價易得、操作簡單、合成路線最短、可以適合工業(yè)生產(chǎn)的高性價比nadph合成路線。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種生物酶法合成nadph的方法，僅需兩步即可獲得目標產(chǎn)物，產(chǎn)率較高，產(chǎn)物分離簡單，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
2、本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
3、一種生物酶法體外合成nadph的方法，將底物nad+、甲酸、甲酸脫氫酶、nadh激酶和緩沖液加入反應(yīng)釜內(nèi)在體外或細胞內(nèi)催化生成nadph，產(chǎn)物經(jīng)離心分離，取上清得到nadh產(chǎn)物溶液；所述甲酸以甲酸銨的形式加入；
4、催化過程為：
5、底物nad+和甲酸在甲酸脫氫酶作用下催化生成co2和nadh；
6、nadh在nadh激酶及atp提供能量下催化生成nadph。
7、反應(yīng)體系中，nad+用量為1～100g/l，甲酸銨用量為30～60g/l，甲酸脫氫酶用量為10～500mg/l，nadh激酶用量為10～500mg/l。
8、反應(yīng)體系的ph為6.5～7.8；反應(yīng)溫度20～40℃，反應(yīng)時間10～20小時。
9、甲酸脫氫酶、nadh激酶均以濕菌體、固定化酶或固定化細胞用量計。
10、緩沖液為磷酸緩沖液或tris-hcl緩沖液。
11、所用atp由atp循環(huán)系統(tǒng)生成，atp循環(huán)系統(tǒng)包括adp激酶、循環(huán)啟動用atp和焦磷酸鈉，其中adp激酶濃度為0.1～10mg/l，循環(huán)啟動用atp初始添加濃度為50～1000mg/l，焦磷酸鈉初始添加濃度為50～1000mg/l，焦磷酸鈉每隔1.5～2小時補加一次。體外合成時采用atp循環(huán)系統(tǒng)提供atp。
12、所用atp由細胞提供。當采用細胞進行nadph的生產(chǎn)時，atp由細胞本身提供。
13、甲酸脫氫酶、nadh激酶均采用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母中的一種工程菌株表達生產(chǎn)。
14、所述甲酸脫氫酶的國際系統(tǒng)分類編號為ec?1.17.1.9；nadh激酶的國際系統(tǒng)分類編號為ec?2.7.1.86。
15、作為優(yōu)選方案，所述甲酸脫氫酶為甲酸脫氫酶ec?1.17.1.9經(jīng)酶改造后而得，具體為：將甲酸脫氫酶ec?1.17.1.9的第121位的賴氨酸k突變?yōu)榻z氨酸s，第284位的亮氨酸l突變?yōu)楸奖彼醘，第353位的苯丙氨酸a突變?yōu)榘腚装彼醕；
16、所述nadh激酶為nadh激酶ec?2.7.1.86經(jīng)酶改造后而得，具體為：將nadh激酶ec2.7.1.86的第173位的氨基酸由亮氨酸l突變?yōu)榘腚装彼醕，第235位的氨基酸由絲氨酸s突變?yōu)樘於彼醖，第268位的氨基酸由丙氨酸a突變?yōu)楸奖彼醘。
17、本專利采用突變后的酶，其酶活相較于初始未突變酶更高，催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率更高，經(jīng)過酶進化改造耐受性有所提高，使得反應(yīng)更穩(wěn)定。
18、本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)的nadph合成路線所采用的nad+起始底物價格便宜，價格約為1000元/kg，具有很好的經(jīng)濟適用性。整個合成路線僅需兩步即可獲得目標產(chǎn)物，產(chǎn)率較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。本專利技術(shù)底物更換為甲酸，產(chǎn)物為二氧化碳，相比于化學(xué)合成法和生物提取法雜質(zhì)更少，無需葡萄糖等其他底物的加入，后期分離純化變得極為方便，對環(huán)境也更為友好。
19、本專利技術(shù)的體外酶法合成路線避免了微生物細胞對目標產(chǎn)物的消耗，提升了整體產(chǎn)率。
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1.一種生物酶法合成NADPH的方法，其特征在于，將底物NAD+、甲酸、甲酸脫氫酶、NADH激酶和緩沖液加入反應(yīng)釜內(nèi)在體外或細胞內(nèi)催化生成NADPH，產(chǎn)物經(jīng)離心分離，取上清得到NADH產(chǎn)物溶液；所述甲酸以甲酸銨的形式加入；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中，NAD+用量為1～100g/L，甲酸銨用量為30～60g/L，甲酸脫氫酶用量為10～500mg/L，NADH激酶用量為10～500mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系的pH為6.5～7.8；反應(yīng)溫度20～40℃，反應(yīng)時間10～20小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，甲酸脫氫酶、NADH激酶均以濕菌體、固定化酶或固定化細胞用量計。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，緩沖液為磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用ATP由ATP循環(huán)系統(tǒng)生成，ATP循環(huán)系統(tǒng)包括ADP激酶、循環(huán)啟動用ATP和焦磷酸鈉，其中ADP激酶濃度為0.1～10mg/L，循環(huán)啟動用AT
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用ATP由細胞提供。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，甲酸脫氫酶、NADH激酶均采用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母中的一種工程菌株表達生產(chǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甲酸脫氫酶的國際系統(tǒng)分類編號為EC?1.17.1.9；NADH激酶的國際系統(tǒng)分類編號為EC?2.7.1.86。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述甲酸脫氫酶為甲酸脫氫酶EC1.17.1.9經(jīng)酶改造后而得，具體為：將甲酸脫氫酶EC?1.17.1.9的第121位的賴氨酸K突變?yōu)榻z氨酸S，第284位的亮氨酸L突變?yōu)楸奖彼酕，第353位的苯丙氨酸A突變?yōu)榘腚装彼酑；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種生物酶法合成nadph的方法，其特征在于，將底物nad+、甲酸、甲酸脫氫酶、nadh激酶和緩沖液加入反應(yīng)釜內(nèi)在體外或細胞內(nèi)催化生成nadph，產(chǎn)物經(jīng)離心分離，取上清得到nadh產(chǎn)物溶液；所述甲酸以甲酸銨的形式加入；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中，nad+用量為1～100g/l，甲酸銨用量為30～60g/l，甲酸脫氫酶用量為10～500mg/l，nadh激酶用量為10～500mg/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系的ph為6.5～7.8；反應(yīng)溫度20～40℃，反應(yīng)時間10～20小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，甲酸脫氫酶、nadh激酶均以濕菌體、固定化酶或固定化細胞用量計。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，緩沖液為磷酸緩沖液或tris-hcl緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用atp由atp循環(huán)系統(tǒng)生成，atp循環(huán)系統(tǒng)包括adp...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳彥，羅志波，曲茂華，杜峰，盧夏鋒，曹敏，馬牧青，章雪琦，
申請(專利權(quán))人：杭州微遠生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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