【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)，具體涉及一種與菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)記及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、菜心(brassica?campestris?l.ssp.chinensis?var.utilis?tsen?etlee)又名菜薹，它是中國(guó)南方種植面積最大的蕓苔科蔬菜之一，栽培歷史悠久，是蕓苔科的一種十字花科蔬菜。它起源于中國(guó)，是黃淮流域的一種特色蔬菜，特別是在山東、江蘇、湖北(yuandpan，2019)，在廣東廣泛種植(jia?et?al.，2019)。菜心是一種以花薹為食用器官的蔬菜，花薹來(lái)源于菜心的分枝。菜心分枝系統(tǒng)由頂端分生組織發(fā)育成的主枝，初生蓮座葉葉腋處發(fā)育形成的初生蓮座枝，莖生葉腋生分生組織發(fā)育的側(cè)枝組成。普通菜心品種只采收主枝，適合密植，機(jī)械化采收；分枝多的連州菜心在蓮座葉上有多腋芽產(chǎn)生，進(jìn)一步發(fā)育成多個(gè)分枝，一次種植可以多次收獲，產(chǎn)量高。
2、菜心資源比較豐富，但遺傳背景狹窄，創(chuàng)新力度不足，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足多樣化的育種需求，對(duì)種質(zhì)資源的認(rèn)識(shí)和挖掘是菜心遺傳育種的源頭，開(kāi)展菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、群體結(jié)構(gòu)分析，對(duì)于菜心遺傳基礎(chǔ)拓展和有效利用具有重要意義，但傳統(tǒng)育種方法耗時(shí)長(zhǎng)、性狀改良慢，難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)需求的問(wèn)題，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種成為突破傳統(tǒng)育種瓶頸的有效方法，而發(fā)掘與菜心分枝的調(diào)控基因，掌握基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)菜心分子育種具有重要意義。
3、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及遺傳多樣性分析在分子標(biāo)記中，indel標(biāo)記是植物基因組中最豐富的遺傳變異，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、全基
4、目前鑒定的控制菜心分枝數(shù)基因很少，尚不能滿足分子育種的需要。若能開(kāi)發(fā)與菜心分枝性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，該標(biāo)記可用于菜心的分子標(biāo)記輔助育種，對(duì)加速創(chuàng)新創(chuàng)制優(yōu)異菜心種質(zhì)資源以及菜心品種的選育工作具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、鑒于上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種與菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)記及應(yīng)用，用于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。
2、本專利技術(shù)的一個(gè)目的在于開(kāi)發(fā)獲得相關(guān)indel連鎖標(biāo)記，以調(diào)控菜心分枝數(shù)量，可應(yīng)用于雜交后代育種材料以及其它菜心材料中分枝性狀的分子鑒定。
3、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)方面，本專利技術(shù)提供了如下技術(shù)方案：
4、上述菜心分枝基因brbc1精細(xì)定位在大白菜第7號(hào)染色體72.5kb物理區(qū)間。
5、菜心分枝相關(guān)基因連鎖的indel標(biāo)記及其應(yīng)用，所述引物分別由a0729的indel分子標(biāo)記引物和a0749的indel分子標(biāo)記引物組成：
6、所述a0729的indel分子標(biāo)記引物序列為：
7、a0729-f/a0729-r:agcctagatttgcaagtaagc/cactgccatagaagcac?acac。
8、所述a0729引物擴(kuò)增的與多分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為192bp，核苷酸序列如seq?id?no.1，與少分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為178bp，核苷酸序列如seqid?no.2。
9、所述a0749的indel分子標(biāo)記引物序列為：
10、a0749-f/a0749-r:cctatgctcaacaggaggaggtcaccgttacagaga?tgct。
11、a0749引物擴(kuò)增的與多分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為165bp，核苷酸序列如seq?id?no.3，與少分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為150bp，核苷酸序列如seq?idno.4。
12、本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是上述的菜心分枝相關(guān)基因連鎖的indel標(biāo)記引物在菜心育種中的應(yīng)用。利用該標(biāo)記可以對(duì)后代分枝數(shù)量進(jìn)行精確篩選，若想獲得多分枝材料，則電泳檢測(cè)篩選出與多分枝性狀一致的特征條帶，若想獲得少分枝材料，則電泳檢測(cè)篩選出與少分枝性狀一致的特征條帶，提高了育種效率，為菜心分枝分子育種提供了一種新的遺傳標(biāo)記。
13、為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采取了以下技術(shù)措施：
14、菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)記及其應(yīng)用，通過(guò)下述方式獲得：
15、(1)游離小孢子培養(yǎng)方法獲得的來(lái)自普通單分枝菜心的雙單倍體(doubledhaploid，dh)系‘cx010’為母本和來(lái)自多分枝連州菜心的dh系‘008(6)’為父本。配制f1，再自交獲得f2代。利用816株f2代菜心植株作為定位群體進(jìn)行分枝基因的定位。從幼苗期就開(kāi)始進(jìn)行表型鑒定，直至分枝表型最明顯時(shí)期進(jìn)行取樣。具體方法：調(diào)查分枝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)為莖基部5cm范圍內(nèi)的分枝數(shù)是莖基部分枝。
16、(2)從f2定位群體中挑選具有多分枝表型(7～10分枝)、少分枝表型(1～3個(gè)分枝)和中間分枝表型(5個(gè)分枝)的植株各50株，使用改良的溴化十六烷三甲基銨(cetyltriethylammonium?bromide，ctab)方法(murray?and?thompson，1980)來(lái)提取dna。提取每個(gè)單株的葉片dna，等量混合，構(gòu)成gradedpool-seq(gps)的三個(gè)混池。利用酶標(biāo)儀對(duì)dna濃度進(jìn)行檢測(cè)。
17、(3)將提取的混池樣本的dna送到杭州聯(lián)川生物科技股份有限公司(杭州，中國(guó))進(jìn)行g(shù)ps測(cè)序?qū)嶒?yàn)。最終定位在a07染色體23400156bp-23799822bp與24411036bp-24999768bp。
18、(4)由于區(qū)間過(guò)大，基因過(guò)多，不利于準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)候選基因。從候選區(qū)間的測(cè)序結(jié)果中選擇突變較為明顯的indel位點(diǎn)，用該位點(diǎn)上下游各150bp的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用親本dna進(jìn)行篩選，篩選出在親本間有多態(tài)性的標(biāo)記。從f2群體中隨機(jī)選擇150棵植株，和親本一起采用qtl基因分型技術(shù)結(jié)合表型數(shù)據(jù)，利用win?qtl?cart?2.5和joinmap?4軟件分析來(lái)進(jìn)一步縮小候選區(qū)間來(lái)實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。利用這種方法，已經(jīng)在番茄和水稻上成功實(shí)現(xiàn)了候選基因的精確定位(liu?et?al.，2019；lei?et?al.，2020)
19、(5)基于上述的技術(shù)措施，實(shí)現(xiàn)brbc1基因在染色體上的遺傳定位，并獲得與brbc1緊密連鎖的indel標(biāo)記a0729和a0749，兩者之間的距離約為72.5kb本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.與菜心分枝基因Brbc1連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于，包括兩個(gè)Indel標(biāo)記，兩個(gè)Indel標(biāo)記分別為A0729和A0749，分別由A0729-F/A0729-R和A0749-F/A0749-R組成，所述標(biāo)記的引物的核苷酸序列如下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與菜心分枝基因Brbc1連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于，所述A0729引物擴(kuò)增的與多分枝性狀連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶為192bp，核苷酸序列如Seq?IDNo.1,與少分枝性狀連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶為178bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與菜心分枝基因Brbc1連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于，所述A0749引物擴(kuò)增的與多分枝性狀連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶為165bp，核苷酸序列如Seq?IDNo.3，與少分枝性狀連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶為150bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與菜心分枝基因Brbc1連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于，所述A0729引物擴(kuò)增包含以下電泳結(jié)果：
5.根據(jù)
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的Indel標(biāo)記在雜交后代育種材料以及其它菜心材料中分枝基因Brbc1的鑒定的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.與菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)記，其特征在于，包括兩個(gè)indel標(biāo)記，兩個(gè)indel標(biāo)記分別為a0729和a0749，分別由a0729-f/a0729-r和a0749-f/a0749-r組成，所述標(biāo)記的引物的核苷酸序列如下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)記，其特征在于，所述a0729引物擴(kuò)增的與多分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為192bp，核苷酸序列如seq?idno.1,與少分枝性狀連鎖的indel標(biāo)記特征條帶為178bp，核苷酸序列如seq?id?no.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與菜心分枝基因brbc1連鎖的indel標(biāo)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：章云，周偉娜，付碩，李浩男，鄭超，李霄宇，武超，龔圣軒，楊君匯，余貴兵，劉志勇，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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