【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，尤其涉及一種利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法及其在鐵死亡研究中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate?dehydrogenase?kinase?4，pdk4）在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用，主要通過抑制丙酮酸脫氫酶的活性來調(diào)節(jié)糖酵解與脂肪酸氧化之間的平衡。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)環(huán)境變化高度敏感。pdk4不僅具有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝功能，還可能參與神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展。在高葡萄糖環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞通常會(huì)增加對(duì)葡萄糖的利用，以適應(yīng)環(huán)境變化，表現(xiàn)為糖酵解水平增加，脂肪酸合成增加，脂肪酸氧化受到抑制，導(dǎo)致能量代謝的失衡。此外，高糖引起小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，從而損傷細(xì)胞功能。在這一過程中，pdk4的表達(dá)上調(diào)，通過抑制丙酮酸脫氫酶的活性，減少丙酮酸向乙酰輔酶a的轉(zhuǎn)化，降低糖酵解產(chǎn)物，即丙酮酸流入三羧酸循環(huán)的速率，進(jìn)而抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸氧化。這種調(diào)控可幫助小膠質(zhì)細(xì)胞在高葡萄糖環(huán)境中維持代謝穩(wěn)態(tài)，減輕氧化損傷，維持細(xì)胞功能。
2、鐵死亡（ferroptosis）是一種依賴于鐵的細(xì)胞死亡方式，其主要通過鐵催化的脂質(zhì)過氧化，尤其是多不飽和脂肪酸（polyunsaturated?fatty?acids，pufa）的氧化產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡；谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione?peroxidase?4，gpx4）是抑制鐵死亡的關(guān)鍵抗氧化酶，能夠有效減少脂質(zhì)過氧化物的積累。gpx4的缺失或功能障礙會(huì)導(dǎo)致
3、研究表明，pdk4可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激中可能發(fā)揮重要作用，通過影響鐵的代謝和抗氧化機(jī)制，pdk4可能在鐵死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，探討pdk4在bv2小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，尤其是在鐵死亡研究中的具體機(jī)制，將為理解神經(jīng)退行性疾病和其他相關(guān)病理狀態(tài)提供新的視角。
4、現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足:
5、目前常用的sirna基因敲低技術(shù)存在性能不穩(wěn)定、成本較高及細(xì)胞株基因穩(wěn)定性差等問題。這些缺陷可能限制了對(duì)pdk4功能的深入研究。因此，開發(fā)更為有效和穩(wěn)定的基因調(diào)控方法，如慢病毒介導(dǎo)的基因敲低或過表達(dá)，將為研究pdk4的生物學(xué)功能提供更為可靠的工具。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)不足，本專利技術(shù)提供一種利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法及其在鐵死亡研究中的應(yīng)用，得到穩(wěn)定低表達(dá)或過表達(dá)pdk4的細(xì)胞株，并系統(tǒng)研究其在鐵死亡中的作用。
2、為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的，擬采用以下方案：
3、一種利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法，包括以下步驟：
4、通過小鼠pdk4基因的全長序列設(shè)計(jì)shrna序列以實(shí)現(xiàn)基因敲低，或設(shè)計(jì)cdna序列以進(jìn)行基因過表達(dá)；
5、構(gòu)建含有shrna序列或cdna序列的慢病毒載體，該載體帶有綠色熒光蛋白gfp和嘌呤霉素抗性基因；然后進(jìn)行慢病毒包裝與純化；
6、獲得并培養(yǎng)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞；將慢病毒感染bv2小膠質(zhì)細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定敲低或穩(wěn)定過表達(dá)pdk4基因的bv2小膠質(zhì)細(xì)胞株。
7、進(jìn)一步的，慢病毒包裝與純化時(shí)將構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞系。
8、進(jìn)一步的，將慢病毒感染bv2小膠質(zhì)細(xì)胞72小時(shí)后，通過6?μg/ml的嘌呤霉素篩選。
9、進(jìn)一步的，慢病毒感染bv2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，加入20?μl?25×hitransg?p感染增強(qiáng)液。
10、進(jìn)一步的，培養(yǎng)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)所使用的培養(yǎng)基：含有10%胎牛血清fbs和1%青霉素-鏈霉素的dmem（含25mm葡萄糖）；培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)定為37℃、95%濕度、5%?co2。
11、一種pdk4基因敲低的bv2小膠質(zhì)細(xì)胞株，采用上述方法得到。
12、一種pdk4基因過表達(dá)的bv2小膠質(zhì)細(xì)胞株，采用上述方法得到。
13、敲低pdk4基因的bv2小膠質(zhì)細(xì)胞株在鐵死亡研究中的應(yīng)用，用于降低gpx4蛋白表達(dá)。
14、過表達(dá)pdk4基因的bv2小膠質(zhì)細(xì)胞株在鐵死亡研究中的應(yīng)用，用于促進(jìn)gpx4的蛋白表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)gpx4的影響。
15、本專利技術(shù)的有益效果在于：
16、1、與傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染方法相比，慢病毒能夠有效感染分裂和非分裂細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞類型的穩(wěn)定基因表達(dá)，特別適用于難以轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞。該技術(shù)通過將目標(biāo)基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，確保長期穩(wěn)定的基因表達(dá)，便于研究基因功能的長期影響。同時(shí)，慢病毒適用于多種細(xì)胞類型和動(dòng)物模型，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究提供了靈活的應(yīng)用平臺(tái)。
17、2、在研究pdk4在bv2小膠質(zhì)細(xì)胞中的功能時(shí)，利用慢病毒技術(shù)可以有效實(shí)現(xiàn)pdk4的特異性敲低和過表達(dá)，從而深入探討其在鐵死亡和神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制。這種方法不僅提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，還為理解pdk4在疾病發(fā)展中的角色提供了強(qiáng)有力的工具。結(jié)合慢病毒技術(shù)與其他細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段，研究者能夠更全面地揭示pdk4的生物學(xué)功能及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞PDK4基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞PDK4基因的方法，其特征在于，慢病毒包裝與純化時(shí)將構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞PDK4基因的方法，其特征在于，將慢病毒感染BV2小膠質(zhì)細(xì)胞72小時(shí)后，通過6?μg/mL的嘌呤霉素篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞PDK4基因的方法，其特征在于，慢病毒感染BV2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，加入20?μL?25×HiTransG?P感染增強(qiáng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞PDK4基因的方法，其特征在于，培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)所使用的培養(yǎng)基：含有10%胎牛血清FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM（含25mM葡萄糖）；培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)定為37℃、95%濕度、5%?CO2。
6.一種PDK4基因敲低的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，其特征在于
7.一種PDK4基因過表達(dá)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，其特征在于，采用權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法得到。
8.敲低PDK4基因的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株在鐵死亡研究中的應(yīng)用，其特征在于，用于降低GPX4蛋白表達(dá)。
9.過表達(dá)PDK4基因的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株在鐵死亡研究中的應(yīng)用，其特征在于，用于促進(jìn)GPX4的蛋白表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)GPX4的影響。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法，其特征在于，慢病毒包裝與純化時(shí)將構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法，其特征在于，將慢病毒感染bv2小膠質(zhì)細(xì)胞72小時(shí)后，通過6?μg/ml的嘌呤霉素篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或過表達(dá)bv2小膠質(zhì)細(xì)胞pdk4基因的方法，其特征在于，慢病毒感染bv2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，加入20?μl?25×hitransg?p感染增強(qiáng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用慢病毒技術(shù)敲低或...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蘇畫畫，劉熙，譚昌洪，陳利芬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。