【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及線粒體提取，具體為一種線粒體膜蛋白肽以及線粒體分離方法。
技術介紹
1、線粒體分離試劑盒是一種實驗室工具，用于從細胞中提取純化的線粒體。這種試劑盒通常包含所有必需的緩沖液離心步驟指南以及操作流程，使得研究人員能夠高效地從不同類型的組織或細胞樣本中分離出線粒體。線粒體是細胞的能量工廠，對于研究能量代謝氧化應激細胞凋亡等生物學過程至關重要。
2、線粒體作為細胞物質和能量代謝的主要細胞器，在維持細胞生理穩態中發揮關鍵作用，進而與諸多疾病的發生發展密切相關。從高度復雜的細胞組分中特異性分離分析線粒體，對于其功能解析分子機制研究和化學干預具有重要意義，但仍存在困難與挑戰。
3、目前現有的線粒體分離試劑盒，超速離心密度梯度離心等技術廣泛用于線粒體分離之中，但仍存在產物純度有限易受細胞碎片等雜質污染干擾等問題，并且現有檢測儀器精度靈敏度較高，在樣本不純的情況下極易導致檢測結果出現偏差情況的出現，為此，我們提出一種線粒體膜蛋白肽以及線粒體分離方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種線粒體膜蛋白肽以及線粒體分離方法，以解決
技術介紹
中需要解決的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種線粒體膜蛋白肽，所述線粒體膜蛋白肽的氨基酸序列為：
3、nh2-gly-gly-gly-phe-(d)arg-phe-lys-phe-(d)arg-phe-lys(ac)-con-h2。
4、作為上述技術方案的進一步
5、一種線粒體分離方法，所述線粒體分離方法包括以下步驟：
6、步驟一：在微球表面修飾線粒體蛋白肽，得到gly封閉的多肽修飾微球，并將多肽修飾微球保存于超純水中；
7、步驟二：利用gly封閉的多肽修飾微球對目標組織進行線粒體提取，得到分離后的線粒體。
8、目前現有的線粒體分離試劑盒，超速離心密度梯度離心等技術廣泛用于線粒體分離之中，但仍存在產物純度有限易受細胞碎片等雜質污染干擾等問題，并且現有檢測儀器精度靈敏度較高，在樣本不純的情況下極易導致檢測結果出現偏差情況的出現，本專利技術操作簡單，時間短，并且通過本方法得到的線粒體純度較高，一定程度上避免了線粒體之外的亞細胞器和細胞碎片的污染，并且純度較高的線粒體在高靈敏度的檢測儀器檢測的情況下不會因為線粒體純度而造成檢測結果出現偏差，并且利用本方法得到的線粒體成本可控，可以為實驗帶來穩定可靠的結果，方便針對線粒體方面研究的下游各種實驗操作；并且本專利技術技術采用基于線粒體膜蛋白特異性親和吸附原理，不用離心，直接通過吸附方式富集分離，富集效率更高，純度更好，為下一步線粒體功能和分子機制研究，蛋白代謝研究提供了更好的基礎。
9、作為上述技術方案的進一步描述：
10、所述步驟一中微球表面修飾多肽包括以下步驟：
11、步驟a1：取5±0.3mg的含有硫酸鹽基團和醛基的微球，加入500ul0.4mg/ml的線粒體蛋白肽水溶液；
12、步驟a2：混合均勻后加入5ml倍量的還原劑，反應12-13h，通過線粒體蛋白肽的n端氨基與微球上的醛基發生氨甲基化反應，將多肽鍵合至微球表面；
13、步驟a3：加入500ul的1mol/l的甘氨酸水溶液，反應2±0.5h，并利用超純水清洗3-5次，得到gly封閉的多肽修飾微球，將得到的gly封閉的多肽修飾微球保存于超純水中。
14、作為上述技術方案的進一步描述：
15、所述步驟二中組織線粒體提取包括以下步驟：
16、步驟s1：稱取50-100ml目標組織，加入pbs洗滌至少一次；
17、步驟s2：將提取目標組織進行分剪，加入勻漿液500±3ul，混合均勻后使用玻璃勻漿器破碎細胞，得到組織勻漿；
18、步驟s3：稱取600±5g組織勻漿，在4±0.5℃的環境下離心處理5-10min；
19、步驟s4：取組織勻漿中的200ul上清液至離心管中；
20、步驟s5：向離心管中加入1mg多肽修飾微球，在4±0.5℃環境下孵育2-3h；
21、步驟s6：對離心管中的組織勻漿和多肽修飾球離心處理，離心處理后丟棄上清液，保留沉淀物，再向離心管中加入200±5ul緩沖液清洗，便可以得到線粒體。
22、作為上述技術方案的進一步描述：
23、所述步驟a2中還原劑選用氰基硼氫化鈉還原劑。
24、作為上述技術方案的進一步描述：
25、所述步驟a2中加入還原劑后在20-25℃的環境下反應12-13h，所述步驟a3中加入甘氨酸水溶液后在溫度為20-25℃的環境下反應2±0.5h。
26、作為上述技術方案的進一步描述：
27、所述步驟s2中加入的500ul勻漿液中含有10mmol/l的磷酸二氫鉀和136?mmol/l的氯化鉀，所述勻漿液的ph值為7.25。
28、作為上述技術方案的進一步描述：
29、所述步驟s6中加入的200ul緩沖液中含有10mmol/l的磷酸二氫鉀和136?mmol/l的氯化鉀，所述緩沖液的ph值為7.25。
30、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
31、1、本專利技術操作簡單，時間短，并且通過本方法得到的線粒體純度較高，一定程度上避免了線粒體之外的亞細胞器和細胞碎片的污染，并且純度較高的線粒體在高靈敏度的檢測儀器檢測的情況下不會因為線粒體純度而造成檢測結果出現偏差，并且利用本方法得到的線粒體成本可控，可以為實驗帶來穩定可靠的結果，方便針對線粒體方面研究的下游各種實驗操作；
32、2、并且本專利技術技術采用基于線粒體膜蛋白特異性親和吸附原理，不用離心，直接通過吸附方式富集分離，富集效率更高，純度更好，為下一步線粒體功能和分子機制研究，蛋白代謝研究提供了更好的基礎。
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1.一種線粒體膜蛋白肽，其特征在于：所述線粒體膜蛋白肽的氨基酸序列為：
2.一種利用權利要求1所述的一種線粒體膜蛋白肽的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述線粒體分離方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟一中微球表面修飾多肽包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟二中組織線粒體提取包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟A2中還原劑選用氰基硼氫化鈉還原劑。
6.根據權利要求5所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟A2中加入還原劑后在20-25℃的環境下反應12-13h，所述步驟A3中加入甘氨酸水溶液后在溫度為20-25℃的環境下反應2±0.5h。
7.?根據權利要求6所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟S2中加入的500uL勻漿液中含有10mmol/L的磷酸二氫鉀和136?mmol/L的氯化鉀，所述勻漿液的PH值為7.25。
8.?根據權利要求7所述的一種
...【技術特征摘要】
1.一種線粒體膜蛋白肽，其特征在于：所述線粒體膜蛋白肽的氨基酸序列為：
2.一種利用權利要求1所述的一種線粒體膜蛋白肽的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述線粒體分離方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟一中微球表面修飾多肽包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟二中組織線粒體提取包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的一種線粒體分離方法，其特征在于：所述步驟a2中還原劑選用氰基硼氫化鈉還原劑。
6.根據權利要求5所述的一種線粒...
【專利技術屬性】
技術研發人員：韓長春，徐輝，
申請(專利權)人：杭州利貞生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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