【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞培養，特別涉及一種體外長期擴增小鼠原代肺泡巨噬細胞的培養方法。
技術介紹
1、巨噬細胞在抗菌防御、組織損傷修復和抗腫瘤等方面發揮著關鍵作用。在體外，利用細胞因子m-csf誘導骨髓前體細胞或血液單核細胞分化為巨噬細胞，被稱為骨髓衍生的巨噬細胞或單核衍生的巨噬細胞。這些體外誘導的巨噬細胞常用來研究原代巨噬細胞的功能。但是這些巨噬細胞壽命有限（7-10天），需要不斷的重新誘導分化才能滿足長期研究的需要。
2、現有的研究方法是用含有10%胎牛血清的完全培養基和gm-csf體外培養肺泡巨噬細胞。因胎牛血清中含有不確定成分的外源性物質，并非任意含血清培養基都可以實現肺泡巨噬細胞長期培養，所以此方法需要測試不同批次的胎牛血清才能找到適合長期培養的血清。血清篩選耗時費力，且需要大量資金支持。
3、如現有技術中云宏芳等（不同條件下小鼠肺泡巨噬細胞體外培養的實驗研究，《中國免疫學雜志》2024年第40卷，第1121頁-1125頁）公開了肺泡巨噬細胞（ams）體外培養方法，利用gm-csf、tgf-β和ppar-γ激動劑羅格列酮（簡稱gtr）培養體系培養分析不同年齡小鼠、不同來源前體細胞產生am樣細胞或ams的特征。其使用dmem完全培養基等含有血清的培養基，培養時間為9d，屬于短期培養。
4、又如現有技術cn109082411b，公開了一種誘導性多能干細胞或擬胚體誘導分化成巨噬細胞的方法，前面六階段均是使用無血清培養基，但是最后一個階段使用有血清培養基用于巨噬細胞的增殖；培養時間也是全過程僅僅4
5、因此需要找到更可靠更穩定的能夠長期培養擴增肺泡巨噬細胞的培養體系。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足之處，本專利技術旨在提出一種體外長期擴增小鼠原代肺泡巨噬細胞的培養方法，通過添加gm-csf、tgfβ和羅格列酮的無血清培養基，解決了肺泡巨噬細胞體外培養時間短，需要篩選特定含血清培養基才能長期體外培養和擴增的問題。
2、為達到上述目的，一方面，本專利技術提供一種小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，將分離獲得的小鼠原代肺泡巨噬細胞在含20-40ng/ml?gm-csf、5-15ng/mltgfβ和0.8-1.2μm羅格列酮的macrophage-sfm無血清培養基中進行擴增培養。
3、進一步地，所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其中所述gm-csf、tgfβ和羅格列酮的濃度分別為30ng/ml、10ng/ml和1μm。
4、進一步地，所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其中所述小鼠原代肺泡巨噬細胞是小鼠肺泡灌洗后分離獲得的肺泡巨噬細胞。
5、進一步地，所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其中所述長期擴增培養指培養超過45天、48天、60天、70天、80天或90天以上。
6、進一步地，所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其中所述長期擴增培養指巨噬細胞仍可以保持增殖。
7、我們方法的優勢是使用的無血清培養基各成分穩定，沒有批次影響，因此不需要耗時耗經費尋找適于體外培養原代肺泡巨噬細胞的血清。此外，無血清培養基不含有異源蛋白。在研究原代肺泡巨噬細胞的體內治療效果時，安全性更高，為未來應用原代肺泡巨噬細胞治療肺部疾病的臨床相關研究奠定基礎。
8、我們在體外建立了一種能夠長期培養并大量擴增原代肺泡巨噬細胞的方法。在這里，我們應用macrophage-sfm無血清培養基和gm-csf/tgfβ/rosiglitazone體外培養新鮮分離的小鼠肺泡巨噬細胞。我們發現此培養體系在體外能夠長期大量擴增肺泡巨噬細胞，并且移植到肺泡巨噬細胞缺失的小鼠體內后，這些體外培養的肺泡巨噬細胞能夠在小鼠體內長期存活。
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1.一種小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，將分離獲得的小鼠原代肺泡巨噬細胞在含20-40ng/ml?GM-CSF、5-15ng/ml?TGFβ和0.8-1.2μM羅格列酮的Macrophage-SFM無血清培養基中進行擴增培養。
2.根據權利要求1所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述GM-CSF、TGFβ和羅格列酮的濃度分別為30ng/ml、10ng/ml和1μM。
3.根據權利要求1所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述小鼠原代肺泡巨噬細胞是小鼠肺泡灌洗后分離獲得的肺泡巨噬細胞。
4.根據權利要求1所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述長期擴增培養指培養超過45天以上。
5.根據權利要求2或3所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述長期擴增培養指培養超過48天、60天、70天、80天或90天以上。
6.根據權利要求5所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述長期擴
...【技術特征摘要】
1.一種小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，將分離獲得的小鼠原代肺泡巨噬細胞在含20-40ng/ml?gm-csf、5-15ng/ml?tgfβ和0.8-1.2μm羅格列酮的macrophage-sfm無血清培養基中進行擴增培養。
2.根據權利要求1所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，其特征在于，所述gm-csf、tgfβ和羅格列酮的濃度分別為30ng/ml、10ng/ml和1μm。
3.根據權利要求1所述的小鼠原代肺泡巨噬細胞的體外長期擴增培養方法，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙殿元，唐麗，侯清瑋，王歡，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，
類型：發明
國別省市：
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