【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及食品安全檢測，具體涉及一種己烷雌酚ic-elisa的建立方法及應用。
技術介紹
1、己烷雌酚(hexestrol,hes)是一種人工合成的非甾體雌激素，在臨床上用于治療在臨床上用于治療前列腺癌、閉經、子宮發育不全、功能性子宮出血和更年期綜合征。然而，由于hes對人類健康和生殖系統的不良影響，也可從經過處理的動物和環境中轉移給人類，hes已被禁止用于人類。由于hes可通過促進蛋白質合成和抑制脂肪聚集來增加動物的體重，農業部門仍在非法使用hes作為生長激素，用于提高畜牧業和水產養殖業的生長速度，這可能會導致環境中的hes暴露。因此，人類不僅會直接暴露于環境中的hes，它還會通過食物鏈進入人體，干擾正常的生理過程，導致癌癥、子宮內膜異位癥、胎兒畸形和代謝紊亂等嚴重的健康問題。
2、迄今為止，已經建立了許多檢測hes的方法，包括氣相色譜-質譜聯用法(gaschromatography?coupled?with?mass?spectrometry,gc-ms)、液相色譜-質譜聯用法(liquid?chromatography?coupled?with?mass?spectrometry,lc-ms)和高效液相色譜法(hplc)。雖然這些方法靈敏度高、選擇性強，但耗時長、成本高、需要專業的技術人員。因此，有必要開發更簡便的方法來測定hes。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提出一種己烷雌酚ic-elisa的建立方法，解決現有技術中耗時長、成本高、需要專
2、本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的：
3、一種己烷雌酚ic-elisa的建立方法，包括以下步驟：
4、1)制備hes-bsa和hes-ova；
5、2)用步驟1)制得的hes-bsa制備anti-hes?mabs；
6、3)己烷雌酚ic-elisa的建立：用碳酸氫鹽緩沖液和步驟1)制得的hes-ova包被elisa板，孵育，封孔，在pbs溶液中加入步驟2)制得的anti-hes?mabs和稀釋后的游離hes標準品，孵育，加入gam?igg-hrp，得到己烷雌酚ic-elisa。
7、進一步地，所述步驟1)中hes-bsa和hes-ova的制備過程：在n2保護下，將1100mghes、3.8g?k2co3-al2o3載體試劑分別先后加入到40.0ml無水丙酮溶液中，再添加0.4ml?4-溴丁酸乙酯，避光條件下攪拌加熱過夜；上層液旋轉蒸發至10ml，分離，甲醇萃取，干燥，濃縮，皂化水解獲得改造后的活性hes(hes-mcpe)；在2.0ml?dmf溶液中先后加入70.0mg?hes-mcpe、24.0mg?nhs、40mg?edc，室溫充分反應5h得到ⅰ號液；將132.0mg?bsa加入4.0ml?pbs溶液中溶解得到ⅱ號液，在4℃條件下，ⅰ號液逐滴加入ⅱ號液中得到最終液；室溫下，最終液作用24h，透析3d，離心，得到hes-bsa；其中hes-mcpe合成過程(a)，以及通過活性酯法合成hes-bsa過程(b)的化學方程式為：
8、@a@
9、
10、@b@
11、
12、進一步地，所述步驟1)中hes-ova的制備過程：在2.0ml?dmf溶液中先后加入70.0mg?hes-mcpe、24.0mg?nhs、40.0mg?edc，室溫充分反應5h得到ⅲ號液；將89.5mg?ova加入4.0ml?pbs溶液中溶解得到ⅳ號液，在4℃條件下，ⅲ號液逐滴加入ⅳ號液中得到最終液；室溫下，最終液作用24h，透析3d，離心，得到hes-ova。
13、進一步地，所述anti-hes?mabs的制備過程：80.0mg?hes-bsa和150.0μlfca完全乳化，免疫3只balb/c小鼠，35d后，第2～5次免疫小鼠采用80.0mg?hes-bsa和150.0μl弗氏不完全佐劑，且每次間隔時間21d；小鼠尾靜脈采血，測定，選擇敏感性最強的小鼠進行雜交瘤制備；融合小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞，經培養基篩選、鑒定、有限稀釋法亞克隆和在石蠟誘發的balb/c小鼠中產生腹水，經離心分離和提純得到anti-hes?mabs。
14、進一步地，通過上述的建立方法構建的己烷雌酚ic-elisa。
15、進一步地，所述己烷雌酚ic-elisa的建立方法在己烷雌酚非診斷目的檢測中的應用。
16、進一步地，所述ic-elisa用于檢測多環境樣本中的hes。
17、與現有技術相比，本專利技術具備以下有益效果：
18、1.本專利技術主要通過在hes的羥基上引入羧基(-cooh)，對半抗原hes進行改造，并與載體蛋白偶聯，生成完全抗原(hes-bsa)，通過hes-bsa免疫動物和雜交瘤技術來生產抗hes抗體(anti-hes?mab)。通過建立檢測己烷雌酚殘留間接競爭elisa方法，以期豐富多環境樣本中對己烷雌酚的殘留篩選積累資料，為多環境樣本中己烷雌酚的監測提供新的檢測手段。
19、2.本專利技術所述己烷雌酚ic-elisa用于檢測多環境樣本中的hes，經實驗驗證，本專利技術的建立方法構建的己烷雌酚ic-elisa的ic50值為1.64ng/ml，檢出限為0.44ng/ml，靈敏度高，實用性強，例如該ic-elisa方法對魚肉樣品的檢測，在不同的添加濃度下，回收率為84.0％-92.9％，cv值低于9.1％。為評價該方法的精密度，在不同的添加濃度下，回收率為84.8％-90.9％，cv值低于7.9％。與己烯雌酚的交叉反應率為7.94％，與其他激素類似物沒有交叉反應，這些結果證實了所建立的ic-elisa方法檢測魚肉中hes的可靠性和重復性。
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1.一種己烷雌酚ic-ELISA的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中所述HES-BSA的制備方法為：N2保護下，1100mg?HES、3.8g?K2CO3-Al2O3載體試劑分別先后加入到40.0mL無水丙酮溶液中，再添加0.4mL?4-溴丁酸乙酯，避光條件下攪拌加熱過夜；上層液旋轉蒸發至10mL，分離，甲醇萃取，干燥，濃縮，皂化水解獲得改造后的活性HES；在2.0mL?DMF溶液中先后加入70.0mgHES-MCPE、24.0mg?NHS、40.0mg?EDC，室溫充分反應5h得到Ⅰ號液；將132.0mg?BSA加入4.0mLPBS溶液中溶解得到Ⅱ號液，在4℃條件下，Ⅰ號液逐滴加入Ⅱ號液中得到最終液；室溫下，最終液作用24h，透析3d，離心，得到HES-BSA。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中所述HES-OVA的制備方法為：在2.0mL?DMF溶液中先后加入70.0mg?HES-MCPE、24.0mg?NHS、40.0mg?EDC，室溫充分反應5h得到Ⅲ號液；將89.5
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述anti-HES?mAbs的制備方法為：將80.0mg?HES-BSA和150.0μL?FCA完全乳化，免疫3只BALB/c小鼠，35d后，第2～5次免疫小鼠采用80.0mg?HES-BSA和150.0μL弗氏不完全佐劑，且每次間隔時間21d；小鼠尾靜脈采血，測定，選擇敏感性最強的小鼠進行雜交瘤制備；融合小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞，經培養基篩選、鑒定、有限稀釋法亞克隆和在石蠟誘發的BALB/c小鼠中產生腹水，經離心分離和提純得到anti-HES?mAbs。
5.根據權利要求1-4任一所述方法在己烷雌酚非診斷目的檢測中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其特征在于：所述ic-ELISA用于檢測多環境樣本中的HES。
...【技術特征摘要】
1.一種己烷雌酚ic-elisa的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中所述hes-bsa的制備方法為：n2保護下，1100mg?hes、3.8g?k2co3-al2o3載體試劑分別先后加入到40.0ml無水丙酮溶液中，再添加0.4ml?4-溴丁酸乙酯，避光條件下攪拌加熱過夜；上層液旋轉蒸發至10ml，分離，甲醇萃取，干燥，濃縮，皂化水解獲得改造后的活性hes；在2.0ml?dmf溶液中先后加入70.0mghes-mcpe、24.0mg?nhs、40.0mg?edc，室溫充分反應5h得到ⅰ號液；將132.0mg?bsa加入4.0mlpbs溶液中溶解得到ⅱ號液，在4℃條件下，ⅰ號液逐滴加入ⅱ號液中得到最終液；室溫下，最終液作用24h，透析3d，離心，得到hes-bsa。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中所述hes-ova的制備方法為：在2.0ml?dmf溶液中先后加入70.0mg?hes-mcpe、24.0mg?nhs、4...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊興東，范素菊，曲揚，毋麗華，王趁趁，
申請(專利權)人：周口師范學院，
類型：發明
國別省市：
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