【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及魚類遺傳育種，尤其涉及一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法。
技術(shù)介紹
0、技術(shù)背景
1、銀鯽(carassius?gibelio)是我國淡水魚類商品化的主要養(yǎng)殖種類之一。銀鯽種質(zhì)資源豐富，由于不同的地理分布，產(chǎn)生了眾多具有明顯差異的地方品系，如彭澤鯽、高背鯽、方正銀鯽等。另外，科研人員培育了異育銀鯽“中科3號”、長豐鯽、異育銀鯽“中科5號”、湘云鯽等多個水產(chǎn)新品種，這些品種在不同養(yǎng)殖時期都顯著推動了我國鯽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。尤其是異育銀鯽“中科3號”和異育銀鯽“中科5號”因具有生長速度快、抗逆性和適應(yīng)性強等特點，成為我國重要的大宗淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種。
2、隨著鯽魚養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量的提升，疾病問題日趨嚴峻，其中病毒性疾病因其傳播速度快，致死率高，病原診斷難和預(yù)防手段不夠成熟等特點，給鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
3、鯽急性鰓出血癥是異育銀鯽養(yǎng)殖過程中造成損失最為嚴重的一種傳染性疾病，病原為鯽皰疹病毒(carassius?auratus?herpesvirus，cahv)。“中科3號”極易感染cahv，“中科5號”在感染cahv后存活率比“中科3號”平均提高12.59％，申請人前期專利cn116267799a公開了一種抗鯽皰疹病毒銀鯽的創(chuàng)制方法，通過基因編輯技術(shù)，在銀鯽中對ptpn6-a和ptpn6-b進行敲除，突變個體的抗病能力相較野生型提高約10％。但這些手段對銀鯽抗病能力的提升程度有限，仍無法有效預(yù)防或控制由皰疹病毒引起異育銀鯽的“鰓出血病”。
4、培育具有更高抗病
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本專利技術(shù)提供了一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法。
2、本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：
3、一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，特異性敲除銀鯽irf10-b基因，獲得irf10-b三個等位基因均提前終止的突變基因型個體即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽；所述irf10-b基因具有兩個特異敲除靶點，序列如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示，所述irf10-b三個等位基因b1、b2和b3均提前終止的突變基因型個體對應(yīng)的等位基因序列分別如seq?id?no:3、seq?id?no:4和seq?id?no:5所示。
4、進一步地，所述敲除的具體方法為，向銀鯽受精卵注射含有irf10-b特異敲除靶位點的sgrna與cas9蛋白混合物獲得f0代嵌合體，f0代銀鯽飼養(yǎng)至性成熟后經(jīng)過雌核生殖獲得f1代，篩選f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止的突變基因型個體，即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽。
5、進一步地，包括以下步驟：
6、s1.獲取濃度為1000～1500ng/μl的irf10-b特異敲除靶位點的sgrna，即irf10-b-sgrna1、irf10-b-sgrna2，備用；
7、s2.分別取2μl?irf10-b-sgrna1、2μl?irf10-b-sgrna2和0.5μl?cas9蛋白混合，得到工作濃度為250-300ng/μl的混合液，用于注射受精卵，每個受精卵的注射量為2nl；
8、s3.注射完成后孵化所述受精卵，獲得f0代嵌合體，f0代養(yǎng)至性成熟后經(jīng)過雌核生殖獲得f1代；
9、s4.選取f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止突變的銀鯽，即為所需抗鯽皰疹病毒銀鯽。
10、進一步地，還包括擴繁步驟，將f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止突變的銀鯽，再次通過雌核生殖方式獲得f2代，f2代均為所需抗鯽皰疹病毒銀鯽。
11、進一步地，所述受精卵由銀鯽成熟的卵子與興國紅鯉雄魚的精子混合受精得到。
12、進一步地，f1代和f2代的雌核生殖的具體操作為，將銀鯽成熟的卵子與興國紅鯉雄魚的精子混合受精并孵化，產(chǎn)生銀鯽全雌性子代。
13、進一步地，所述irf10-b特異敲除靶位點的sgrna的制備方法為，用irf10-b-sgrna1-f和sgrna-r以及irf10-b-sgrna2-f和sgrna-r引物對，以puc19-grna質(zhì)粒為模板進行pcr擴增，得到irf10-b-sgrna1以及irf10-b-sgrna2片段，再對irf10-b-sgrna1以及irf10-b-sgrna2片段進行sgrna的體外轉(zhuǎn)錄，并對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化回收，得到所需的sgrna；所述irf10-b-sgrna1-f的序列如seq?id?no:6所示，所述irf10-b-sgrna2-f的序列如seq?id?no:7所示，所述sgrna-r的序列如seq?id?no:8所示。
14、進一步地，選取f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止突變的銀鯽的方法為：分別單獨提取f1代成魚鰭條基因組dna，使用檢測引物進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性單克隆測序，對測序結(jié)果進行分析，選擇irf10-b三個等位基因的序列分別如seq?id?no:3、seq?id?no:4和seq?id?no:5所示的突變型銀鯽。
15、進一步地，所述檢測引物的上游引物序列如seq?id?no:9所示，下游引物如seq?idno:10所示。
16、本專利技術(shù)的有益效果在于：
17、鯽和銀鯽屬于鯽屬復(fù)合種，基因組學分析揭示了鯽是起源于早期的一輪異源多倍化事件形成的雙二倍體(aabb)，而在鯽的基礎(chǔ)上又經(jīng)歷了一次同源多倍化事件形成了異源同源雙三倍體銀鯽(aaabbb)。多倍化后銀鯽中每個基因包含來自兩個祖先的基因拷貝，被稱為部分同源基因(a或b)，其中每個部分同源基因有3個等位基因。兩個部分同源基因在進化過程中會出現(xiàn)不同的演化命運，比如假基因化、新功能化、亞功能化或丟失等。
18、irf10為鳥類和硬骨魚類中特有的基因，普遍存在于二倍體魚類中。已有研究在模式物種二倍體斑馬魚中通過細胞內(nèi)過表達的方法報道了irf10在體外具有負調(diào)控干擾素的作用。然而對于該基因體內(nèi)的功能研究尚不清楚。此外，銀鯽由于經(jīng)歷了多倍化事件，與二倍體魚類相比基因功能更加復(fù)雜。例如，foxl2在斑馬魚中調(diào)控斑馬魚卵巢的發(fā)育和維持；而在銀鯽中foxl2的部分同源基因除了協(xié)同調(diào)控銀鯽的濾泡發(fā)生和卵巢發(fā)育，還在卵子發(fā)生過程中發(fā)揮功能。因此，irf10在多倍體銀鯽中的功能尚未可知。
19、本研究首次發(fā)現(xiàn)，銀鯽在經(jīng)歷了額外的兩輪多倍化事件后，irf10的兩個部分同源基因具有不同的演化命運，其中irf10-a在進化中發(fā)生了丟失，同時驗證了irf10-b在銀鯽中的功能。
20、本專利技術(shù)通過生信分析發(fā)現(xiàn)銀鯽中irf10-a發(fā)生了丟失，并通過克隆獲得了irf10-b三個等位基因的cds序列。隨后，通過設(shè)計高效的基因編輯靶點在“中科3號”品系中對irf10-b進行了敲除，獲得了分別敲除一個、兩個和三個等位基因的f2本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，特異性敲除銀鯽irf10-B基因，獲得irf10-B三個等位基因均提前終止的突變基因型個體即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽；所述irf10-B基因具有兩個特異敲除靶點，序列如SEQID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，所述irf10-B三個等位基因B1、B2和B3均提前終止的突變基因型個體對應(yīng)的等位基因序列分別如SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述敲除的具體方法為，向銀鯽受精卵注射含有irf10-B特異敲除靶位點的sgRNA與Cas9蛋白混合物獲得F0代嵌合體，F(xiàn)0代銀鯽飼養(yǎng)至性成熟后經(jīng)過雌核生殖獲得F1代，篩選F1代中irf10-B三個等位基因均提前終止的突變基因型個體，即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述受精卵由銀鯽成熟的卵子與興國紅鯉雄魚的精子混合受精得到。
6.如權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，F(xiàn)1代和F2代的雌核生殖的具體操作為，將銀鯽成熟的卵子與興國紅鯉雄魚的精子混合受精并孵化，產(chǎn)生銀鯽全雌性子代。
7.如權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述irf10-B特異敲除靶位點的sgRNA的制備方法為，用irf10-B-sgRNA1-F和sgRNA-R以及irf10-B-sgRNA2-F和sgRNA-R引物對，以pUC19-gRNA質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，得到irf10-B-sgRNA1以及irf10-B-sgRNA2片段，再對irf10-B-sgRNA1以及irf10-B-sgRNA2片段進行sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄，并對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化回收，得到所需的sgRNA；所述irf10-B-sgRNA1-F的序列如SEQ?ID?NO:6所示，所述irf10-B-sgRNA2-F的序列如SEQ?ID?NO:7所示，所述sgRNA-R的序列如SEQ?ID?NO:8所示。
8.如權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，選取F1代中irf10-B三個等位基因均提前終止突變的銀鯽的方法為：分別單獨提取F1代成魚鰭條基因組DNA，使用檢測引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性單克隆測序，對測序結(jié)果進行分析，選擇irf10-B三個等位基因的序列分別如SEQ?ID?NO:3、SEQ?IDNO:4和SEQ?ID?NO:5所示的突變型銀鯽。
9.如權(quán)利要求8所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述檢測引物的上游引物序列如SEQ?ID?NO:9所示，下游引物如SEQ?ID?NO:10所示。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，特異性敲除銀鯽irf10-b基因，獲得irf10-b三個等位基因均提前終止的突變基因型個體即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽；所述irf10-b基因具有兩個特異敲除靶點，序列如seqid?no:1和seq?id?no:2所示，所述irf10-b三個等位基因b1、b2和b3均提前終止的突變基因型個體對應(yīng)的等位基因序列分別如seq?id?no:3、seq?id?no:4和seq?id?no:5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述敲除的具體方法為，向銀鯽受精卵注射含有irf10-b特異敲除靶位點的sgrna與cas9蛋白混合物獲得f0代嵌合體，f0代銀鯽飼養(yǎng)至性成熟后經(jīng)過雌核生殖獲得f1代，篩選f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止的突變基因型個體，即為所需高抗鯽皰疹病毒銀鯽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，還包括擴繁步驟，將f1代中irf10-b三個等位基因均提前終止突變的銀鯽，再次通過雌核生殖方式獲得f2代，f2代均為所需抗鯽皰疹病毒銀鯽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，所述受精卵由銀鯽成熟的卵子與興國紅鯉雄魚的精子混合受精得到。
6.如權(quán)利要求3所述的一種提高銀鯽抵抗鯽皰疹病毒能力的方法，其特征在于，f1代和f2代...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊小麗，周莉，桂建芳，李志，汪洋，李順，余鵬，林橋洪，王忠衛(wèi)，魯蒙，張曉娟，
申請(專利權(quán))人：中國科學院水生生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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