【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于免疫細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、自然殺傷細(xì)胞(natural?killer?cells,?nk?cells)是先天免疫系統(tǒng)中的一種重要效應(yīng)細(xì)胞，因其能夠在無需抗原呈遞的情況下直接識別并殺傷病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞而得名。nk細(xì)胞在免疫監(jiān)視和清除異常細(xì)胞方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與t細(xì)胞和b細(xì)胞不同，nk細(xì)胞不依賴于特異性抗原受體，具有天然的細(xì)胞毒性，并能通過分泌細(xì)胞因子(如ifn-γ)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。隨著免疫治療的發(fā)展，nk細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用潛力受到了廣泛關(guān)注。研究表明，nk細(xì)胞在抗腫瘤、抗病毒感染和移植免疫等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。然而，nk細(xì)胞在外周血中的含量較低，難以滿足臨床治療需求。因此，開發(fā)有效的體外擴(kuò)增方法以獲得足夠數(shù)量和功能活性的nk細(xì)胞，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。由于nk細(xì)胞在體內(nèi)的比例較低，僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral?blood?mononuclear?cells,?pbmc)的5-15%，直接應(yīng)用未擴(kuò)增的nk細(xì)胞在數(shù)量上不足以產(chǎn)生顯著的治療效果。因此，體外擴(kuò)增技術(shù)被視為提高nk細(xì)胞數(shù)量和活性的重要手段。通過體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，可以獲得大量高純度、高活性的nk細(xì)胞，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供充足的細(xì)胞資源。然而，傳統(tǒng)的nk細(xì)胞擴(kuò)增方法存在效率不高、細(xì)胞活性不穩(wěn)定等問題，因此，開發(fā)一種更加高效和可控的nk細(xì)胞體外擴(kuò)增方法是極其有必要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本專利技術(shù)的目的在于提供一種nk細(xì)胞的體外
2、本專利技術(shù)所述的技術(shù)效果通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
3、s1：用移液管取6ml?pbs緩沖液加入到t75培養(yǎng)瓶中，加入10μg/ml的cd16，配制成cd16工作液，擰緊瓶蓋，上下緩慢顛倒，使cd16充分在瓶底分散后；封口膜封閉裝入袋子中封起來，然后于4℃放置過夜；
4、s2：抽取50ml全血放入無菌肝素鈉采血管中，顛倒數(shù)次混勻；
5、s3：室溫下，對步驟s2中處理后的全血進(jìn)行離心處理，離心結(jié)束后，用移液管將上層血漿轉(zhuǎn)入離心管，然后放入水浴鍋，56℃滅活30min；
6、s4：將步驟s3中滅活后的血漿置于4℃冰箱20～30min，然后從冰箱取出血漿，以3000rpm離心5min，取上清備用，獲得預(yù)處理血漿；
7、s5：將步驟s4中離心后的下層沉淀用等體積的生理鹽水重懸混勻；將5ml淋巴細(xì)胞分離液置于離心管并緩慢加入5ml已重懸混勻的血細(xì)胞，然后室溫離心處理；
8、s6：完成s5步驟中離心處理后，吸取離心液中間的白膜層，將白膜層放入新的離心管中，用生理鹽水重懸混勻定容至50ml，2000rpm離心處理5min，棄上清，重復(fù)重懸定容、離心操作處理一次，獲得細(xì)胞沉淀；
9、s7：將rpmi-1640培養(yǎng)基和營養(yǎng)增補(bǔ)液以9:1的體積比例混合均勻配成完全培養(yǎng)液；
10、s8：將步驟s6中制備的細(xì)胞沉淀加入步驟s7中配制的9ml完全培養(yǎng)液中，重懸并混勻，然后加入133μl的ok432、100μl的il-15和步驟s4中制備的1ml預(yù)處理血漿，獲得細(xì)胞懸液；
11、s9：將步驟s8中制備的細(xì)胞懸液加入到步驟s1中制備的t75培養(yǎng)瓶中，并置于培養(yǎng)箱中37℃，5%co2培養(yǎng)；
12、s10：第一次補(bǔ)液操作，在完成步驟s9培養(yǎng)操作后的第2天，取9ml步驟s7中制備的完全培養(yǎng)液，加到50ml離心管中，將ok432和、il-15和步驟s4中制備的預(yù)處理血漿按照20μl:15μl:1.5ml的比例混合充分混勻后，緩慢加入培養(yǎng)瓶中，確保培養(yǎng)瓶中液體終體積為25ml，放入37℃，5%co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
13、s11：第二次補(bǔ)液操作，在完成步驟s10的第一次補(bǔ)液操作后的第2～3天，將步驟s7制備的完全培養(yǎng)液和步驟s4中制備的預(yù)處理血漿按照32ml:3ml的比例加入到50ml離心管中充分混勻后，緩慢加入培養(yǎng)瓶中，確保培養(yǎng)瓶中液體終體積為60ml，放入37℃，5%co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
14、s12：第三次補(bǔ)液操作，在完成步驟s11的第二次補(bǔ)液操作后的第2天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至t175培養(yǎng)瓶中，加入10ml步驟s4中制備的預(yù)處理血漿，然后補(bǔ)加步驟s7中制備的完全培養(yǎng)液，確保培養(yǎng)瓶中液體終體積為150ml；
15、s13：第四次補(bǔ)液操作，在完成步驟s12的第三次補(bǔ)液操作后的第2天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液平均分配至兩個(gè)t225培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入6～7ml步驟s4中制備的預(yù)處理血漿，然后用步驟s7制備的完全培養(yǎng)液補(bǔ)充每個(gè)培養(yǎng)瓶中液體終體積至200ml，共計(jì)400ml；
16、s14：將營養(yǎng)增補(bǔ)液和optivitro?t細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以0.8:9.2的體積比例混勻配成完全無血清培養(yǎng)液；
17、s15：第五次補(bǔ)液操作，在完成步驟s13的第四次補(bǔ)液操作后的第2天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液平分至4個(gè)t225培養(yǎng)瓶中，記錄為t225-1、t225-2、t225-3和t225-4，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加步驟s14中制備的完全無血清培養(yǎng)液，確保每個(gè)培養(yǎng)瓶中液體終體積為200ml；
18、s16：第六次補(bǔ)液，在完成步驟s15的第五次補(bǔ)液操作后的第2天，消毒培養(yǎng)袋連接口，并將連接口與注射器口相連，準(zhǔn)備裝袋；取出步驟s15中的t225-1和t225-2，拍打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞重懸，然后加入培養(yǎng)袋中，加入步驟s14中制備的完全無血清培養(yǎng)液，并沖洗培養(yǎng)瓶，確保培養(yǎng)袋液體終體積為800ml；裝袋完成后以同樣操作對步驟s15中的t225-3和t225-4進(jìn)行裝袋；
19、s17：第七次補(bǔ)液，在完成步驟s16的第六次補(bǔ)液操作后的第2天，補(bǔ)加步驟s14中制備的完全無血清培養(yǎng)液至每袋培養(yǎng)袋液體終體積為1050ml，兩袋共計(jì)2100ml；
20、s18：在完成步驟s17的第七次補(bǔ)液操作后的第2～3天，分別將兩個(gè)培養(yǎng)袋中的細(xì)胞收集至兩個(gè)500ml離心瓶中，記錄為離心瓶-1和離心瓶-2，向離心瓶-1中加入50ml生理鹽水后將其細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心瓶-2中，然后補(bǔ)加生理鹽水至離心瓶液體終體積500ml，離心收集沉淀，加入10～20ml生理鹽水和2～3ml的營養(yǎng)保存液，混合后裝袋，以1℃/min的速度逐漸降低溫度直到達(dá)到-80℃，冷凍保存。
21、優(yōu)選地，步驟s1中，所述cd16工作液中cd16的質(zhì)量濃度為1μg/ml；
22、優(yōu)選地，步驟s3中，所述離心處理的具體參數(shù)為1800rpm，升9降7，時(shí)間15min；
23、優(yōu)選地，步驟s5中，所述離心處理的具體參數(shù)為2000rpm，升9降0，時(shí)間20min；所述淋巴細(xì)胞分離液以pbs緩沖液為溶劑通過ficoll密度梯度離心法制備獲得；
24、優(yōu)選地，步驟s6中，所述中間的白膜層為兩液面交界處的細(xì)胞層。
25、優(yōu)選地，步驟s7中，所述本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S1中，所述CD16工作液中CD16的質(zhì)量濃度為1μg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S3中，所述離心處理的具體參數(shù)為1800rpm，升9降7，時(shí)間15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S5中，所述離心處理的具體參數(shù)為2000rpm，升9降0，時(shí)間20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S6中，所述中間的白膜層為兩液面交界處的細(xì)胞層。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S7中，所述營養(yǎng)增補(bǔ)液的具體制備步驟如下：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S8中所述OK432和IL-15的添加使用濃度均為1μg/mL；步驟S10中所述OK432和IL-15的添加使用濃度
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S18中所述收集操作為2000～3000rpm離心5～8min，棄上清，重復(fù)離心操作兩次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S18中所述營養(yǎng)保存液的具體制備步驟如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟s1中，所述cd16工作液中cd16的質(zhì)量濃度為1μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟s3中，所述離心處理的具體參數(shù)為1800rpm，升9降7，時(shí)間15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟s5中，所述離心處理的具體參數(shù)為2000rpm，升9降0，時(shí)間20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟s6中，所述中間的白膜層為兩液面交界處的細(xì)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉天津，黃歡，劉凱年，
申請(專利權(quán))人：濰坊吉濤醫(yī)學(xué)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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