【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、缺血性腦卒中是因腦部血流供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性壞死，引發(fā)的一種急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)。目前，臨床上主要采用溶栓、抗血小板聚集、降脂、降壓等治療手段，但治療效果有限且存在一定的副作用。因此，開發(fā)新型的預(yù)防和治療缺血性腦卒中的藥物具有重要意義。
2、經(jīng)檢索，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮閏n202110627046.6的申請(qǐng)方案，公開了一種氣體神經(jīng)保護(hù)劑，為氬氧混合氣。氣體神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)nlrp3炎癥小體起抑制作用的研究方法包括如下步驟：s1、建立缺血性腦卒中的動(dòng)物和細(xì)胞模型；s2、在細(xì)胞模型上觀察氬氣對(duì)脂多糖刺激的原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥激活的影響和分子機(jī)制；s3、探討氬氣對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化中nlrp3炎癥小體的調(diào)控在腦缺血再灌損傷的神經(jīng)保護(hù)中作用。上述專利中的氣體神經(jīng)保護(hù)劑存在以下不足：獲取足夠數(shù)量的高質(zhì)量細(xì)胞用于臨床應(yīng)用方面相對(duì)困難，維持特定表型的比例可能較低，需要復(fù)雜的篩選和培養(yǎng)過程，還有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用了如下技術(shù)方案：
3、spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，包括：
4、s1：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料：
5、s11：確保選擇健康雄性spf級(jí)spra
6、s12：準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和材料，包括ripa裂解液、bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒、脫脂奶粉、化學(xué)發(fā)光試劑、sds-page上樣緩沖液、sds-page凝膠制備試劑盒、mcao線栓、spp1抗體、mag抗體、mbp抗體、β-actin抗體、hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗、hrp標(biāo)記的羊抗兔二抗、pvdf膜和腺相關(guān)病毒等；
7、s2：腦立體注射腺相關(guān)病毒：
8、s21：在造模前二十一天，仔細(xì)準(zhǔn)備aav-oe-spp1和aav-egfp(約1×1013感染單位/毫升)；
9、s22：緩慢注射5μl的aav-oe-spp1或aav-egfp到側(cè)腦室；
10、s23：注射后，注射器放置至少5分鐘才取出，以防止回流并確保病毒完全分散；
11、s3：動(dòng)物模型的建立：
12、s31：采用線栓法構(gòu)建i/r模型；
13、s32：用2％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠；
14、s33：將大鼠固定于動(dòng)物手術(shù)板上，備皮后做頸正中切口；
15、s34：暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈；
16、s35：結(jié)扎左頸總動(dòng)脈近心端，兩端之間剪一小口并插入硅膠線栓，造成局灶性缺血；
17、s36：i/r?120min后移除線栓，完成血管阻塞后的復(fù)灌；
18、s37：假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作同前，尼龍線僅插入約6mm；
19、s4：迷走神經(jīng)電刺激：
20、s41：使用華佗牌電子針療儀sdz-v；
21、s42：大鼠缺血阻塞30min后，小心分離出左側(cè)迷走神經(jīng)；
22、s43：將vns刺激電極放置在左側(cè)迷走神經(jīng)處給予60min重復(fù)電刺激；
23、s44：刺激參數(shù)為：0.5ma方波，波寬0.5ms，頻率20hz，一次連續(xù)30s，每隔5min一次；
24、s45：隨后將大鼠放置在電熱毯上，體溫維持在37℃，直至蘇醒；
25、s46：蘇醒后，將模型單獨(dú)分籠，自由進(jìn)食、飲水；
26、s47：連續(xù)干預(yù)3天后取材進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。
27、優(yōu)選的：所述s1中：
28、ripa裂解液(強(qiáng))：用于從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)；選擇適合細(xì)胞和組織的配方，確保包含有效抑制蛋白酶和磷酸酶活性的成分以保持蛋白完整性；
29、bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒：用于測(cè)定樣本中蛋白的濃度，以便在蛋白電泳前調(diào)整樣品加載量；
30、脫脂奶粉：用于western?blot中的膜封閉，以減少非特異性抗原結(jié)合；
31、化學(xué)發(fā)光試劑：用于western?blot檢測(cè)中，與特定抗體結(jié)合后產(chǎn)生信號(hào)，以便在膜上可視化蛋白帶；
32、sds-page上樣緩沖液：用于制備sds-page電泳樣品，包含sds使蛋白變性，并加入還原劑如β-巰基乙醇以破壞蛋白內(nèi)部二硫鍵；
33、sds-page凝膠制備試劑盒：包含制備聚丙烯酰胺凝膠的所有必要化學(xué)品和緩沖液，用于分離不同分子量的蛋白質(zhì)；
34、mcao線栓：用于手術(shù)導(dǎo)入大鼠頸動(dòng)脈以觸發(fā)局灶性腦缺血，選擇適當(dāng)直徑和長(zhǎng)度的線栓以適配大鼠的血管尺寸；
35、spp1抗體、mag抗體、mbp抗體：分別針對(duì)分泌型磷蛋白1(spp1)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(mag)和髓鞘堿性蛋白(mbp)，用于檢測(cè)和定量這些蛋白的表達(dá)；
36、β-actin抗體：用作western?blot的內(nèi)部控制，以確定樣本加載量的一致性；
37、hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗：繼一次抗體結(jié)合后，使用與一抗物種相對(duì)應(yīng)的hrp標(biāo)記的二抗以進(jìn)行免疫檢測(cè)；
38、pvdf膜：用于western?blot中轉(zhuǎn)移和固定蛋白質(zhì)，以便進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；
39、腺相關(guān)病毒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定制含有spp1過表達(dá)構(gòu)建或?qū)φ誩gfp的aav載體，確定合適的病毒滴度和純度。
40、優(yōu)選的：所述s21中，準(zhǔn)備aav-oe-spp1和aav-egfp，具體如下：
41、設(shè)計(jì)并構(gòu)建含有spp1過表達(dá)序列的腺相關(guān)病毒載體，同時(shí)制備編碼egfp的對(duì)照載體；
42、選擇合適的病毒骨架，如aav9；
43、在gmp級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增并純化病毒，以確保無菌和無致病性；
44、通過定量pcr方法確定病毒滴度，確保感染單位(iu)達(dá)到1×1013iu/ml；
45、在注射前，將病毒儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，并在使用時(shí)逐步解凍至冰上。
46、優(yōu)選的：所述s36中，移除線栓，完成血管阻塞后的復(fù)灌，具體如下：
47、確認(rèn)局部缺血時(shí)間已達(dá)120分鐘；
48、在無菌條件下迅速但小心地移除硅膠線栓，以恢復(fù)血流，避免進(jìn)一步的組織損傷；
49、結(jié)扎頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)端，確保血流復(fù)灌并減少出血風(fēng)險(xiǎn)；
50、縫合切口，用抗生素處理以防止可能的感染，并將大鼠置于溫暖的環(huán)境中恢復(fù)；
51、監(jiān)測(cè)大鼠的行為和生理指標(biāo)，包括神經(jīng)功能評(píng)分和體溫，以確保其健康狀態(tài)并評(píng)估模型的成功建立。
52、優(yōu)選的：所述脫脂奶粉用于westernblot中的膜封閉，以減少非特異性抗原結(jié)合，具體如下：
53、準(zhǔn)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述S11中，選擇健康雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠，7-8周齡，250-280g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述S22中，注射后，注射器放置至少5分鐘后取出，以防止回流并確保病毒完全分散。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述S32中，用2％戊巴比妥鈉，按照50mg/kg，腹腔注射麻醉大鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述S43中，電刺激的刺激參數(shù)為：0.5mA方波，波寬0.5ms，頻率20HZ，一次連續(xù)30s，每隔5min一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述S1中：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SPP1在
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述脫脂奶粉用于WesternBlot中的膜封閉，具體如下：
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述SDS-PAGE上樣緩沖液制備SDS-PAGE電泳樣品，具體如下：
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的SPP1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述SPP1抗體、MAG抗體、MBP抗體用于檢測(cè)和定量蛋白的表達(dá)，具體如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述s11中，選擇健康雄性spf級(jí)sprague-dawley大鼠，7-8周齡，250-280g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述s22中，注射后，注射器放置至少5分鐘后取出，以防止回流并確保病毒完全分散。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述s32中，用2％戊巴比妥鈉，按照50mg/kg，腹腔注射麻醉大鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的spp1在制備預(yù)防和治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述s43中，電刺激的刺激參數(shù)為：0.5ma方波，波寬0.5ms，頻率20hz，一次連續(xù)30...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王思思，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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