【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物基因工程領域，特別涉及一種高效敲除熒光假單胞菌flic基因的方法。
技術介紹
1、熒光假單胞菌(p.fluorescens)是一種環境污染菌。對于人類是一種罕見的機會致病菌。熒光假單胞菌屬于假單胞菌屬，是化能異養型的革蘭氏陰性菌，呈桿狀，有鞭毛。能分泌黃綠色熒光色素發出熒光，能產生抗生素、水解酶等代謝產物，在4℃-37℃范圍內，中性環境中生長，生理生化特性顯著，作為嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。
2、鞭毛是細菌的運動器官，其不僅能幫助細菌侵入宿主細胞，而且在細菌致病過程中發揮著毒性作用。鞭毛蛋白是鞭毛的亞單位蛋白，不同細菌的鞭毛蛋白具有不同的結構與功能。不同細菌的鞭毛蛋白在結構、大小和功能上存在差異。即使是同一種細菌的不同鞭毛蛋白也具有不同的免疫功能。由于鞭毛蛋白具有很強的免疫激活作用，所以鞭毛蛋白已廣泛用于疫苗研發。目前，鞭毛蛋白在結構、免疫功能、信號通路等方面的研究逐漸增多，這有助于我們加深對鞭毛蛋白的認識，然而有關熒光假單胞菌鞭毛蛋白的研究卻相對較少。而基因敲除技術為我們提供了一個有效研究鞭毛蛋白的思路與方法，可以通過構建鞭毛蛋白缺失型突變株來研究鞭毛蛋白的功能機制。
3、細菌的基因敲除是一種反向的遺傳學研究方法，屬于遺傳工程基因改造技術，主要是針對某個感興趣的遺傳基因，通過改變或刪除其基因序列，將生物體特定的基因精確失活或缺失，從而導致該基因功能喪失，這樣就可以進一步對比表型性狀的變化，或研究該基因缺失型突變株的相關理化特征，進而推測該基因的生物學功能。目前細菌基因敲除的方法
4、目前，有關熒光假單胞菌基因敲除的方法大多存在轉化效率低、同源臂長、操作繁瑣等問題，這在一定程度上限制了該菌的基因功能研究。因此，建立適用于熒光假單胞菌的基因敲除技術，將為該菌的毒力和致病性的研究提供重要的參考依據。同時，針對熒光假單胞菌制定高效的基因敲除方案可為細菌基因編輯技術的發展及應用增添重重的一筆。本專利技術通過構建鞭毛蛋白缺失型突變株不僅有助于揭示鞭毛蛋白的功能機制，而且可為細菌基因敲除技術的改進與發展提供重要借鑒。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于一種高效敲除熒光假單胞菌flic基因的方法。
2、一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，包括以下步驟：
3、s1、取出低溫保存的菌株，劃線培養，挑取單克隆接種到lb無抗的液體培養基，并使用對數生長期的細菌開展基因敲除實驗；
4、s2、檢測分析熒光假單胞菌對抗生素的敏感度，并選擇敏感度最高的抗生素作為質粒轉染細菌的篩選抗生素；
5、s3、采用重疊延伸pcr擴增技術構建上下游同源臂，獲得融合的目的基因片段，用融合的目的基因片段構建成載體，并轉化ecoli?dh5alpha細胞；
6、s4、使用質粒載體pt18sacb對目的基因進行無縫克隆連接，轉化ecoli?s17pir感受態細胞；
7、s5、以攜帶flic-pt18sacb的ecoli?s17-1λpir細菌作為重組質粒的供體菌，以熒光假單胞菌作為受體菌，進行結合轉移實驗；
8、s6、使用10％蔗糖誘導雙交換，并使用進行篩選。
9、s1步驟中，低溫保存溫度為-80℃，劃線接種的菌株選用熒光假單胞菌的菌液，培養的溫度為37℃。
10、s2步驟中，所用于檢測的抗生素選用amp(氨芐西林)、kan(卡那霉素)、spc(壯觀霉素)、cm(氯霉素)、gen(慶大霉素)、tc(四環素)、str(鏈霉素)和apr(安普霉素)其中的一種。
11、s3步驟中，以提取的熒光假單胞菌dna為模板，分別采用引物flic-up-f/flic-up-r、flic-down-f/flic-down-r進行pcr擴增，得到擴增產物即為flic的上游同源臂、下游同源臂；
12、以擴增產物flic的上游同源臂、下游同源臂為模板，用引物flic-up-f/flic-down-r進行融合pcr擴增，獲得融合的目的基因片段。
13、將融合的目的基因片段接入puxt載體得到flic-ud-t質粒并轉化ecoli?dh5alpha細胞，并用通用引物m13-f(puc)/m13-r(puc)(puc)擴增篩選陽性克隆pcr，擴增條件如下：94℃5min?30cycle(94℃30sec、55℃30sec、72℃1min)10℃hold?on。
14、引物flic-up-f/flic-up-r、flic-down-f/flic-down-r的pcr擴增體系為：94℃5min30cycle(94℃30sec、55℃30sec、72℃40sec)10℃hold?on；
15、引物flic-up-f/flic-down-r的pcr擴增體系為：94℃5min?2cycle(94℃30sec、50℃30sec、68℃1min),30cycle(94℃30sec、55℃30sec、68℃1min)10℃hold?on。
16、引物的堿基序列如下：
17、flic-up-f：tgctgtattgcgcgttgatcgag；
18、flic-up-r：acccacgaggatttcgtctagccatcggtagatgactgac；
19、flic-down-r：atcgacgcgctgatcgttgtgac；
20、flic-down-f：catctaccgatggctagacgaaatcctcgtgggtggtgta。
21、s4步驟中，用flic-ud-t質粒為模板使用引物(flic-pt18-smai-f/flicpt18-smai-r)進行擴增獲得目的基因片段；pt18sacb在smai位點進行單酶切后對目的基因片段進行無縫克隆連接，并將重組載體冰上放置30min，化學轉化ecoli?s17?pir感受態細胞，涂布于含所選抗生素的抗性平板，并使用引物(m13-f(puc)/m13-r(puc))進行菌落pcr鑒定。
22、s6步驟中，使用引物flic-jd-f/flic-jd-r對敲除菌株進行pcr鑒定，再使用引物flic-ter-f/flic-ter-r對敲除菌進行二次鑒定，最后對pcr擴增產物進行測序鑒定。
23、一種敲除flic基因的熒光假單胞菌(atcc13525)，采用如權利要求1-9任一項所述的高效敲除熒光假單胞本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：
3.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：
4.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：S3步驟中
5.根據權利要求4一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：
6.根據權利要求4所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：
7.根據權利要求4或6所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于，引物的堿基序列如下：
8.根據權利要求5所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法，其特征在于：
9.根據權利要求5所述的一種高效敲除熒光假單
10.一種敲除flic基因的熒光假單胞菌(ATCC13525)，其特征在于，采用如權利要求1-9任一項所述的高效敲除熒光假單胞菌(ATCC13525)flic基因的方法制備而成。
...【技術特征摘要】
1.一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，其特征在于：
3.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，其特征在于：
4.根據權利要求1所述的一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，其特征在于：s3步驟中
5.根據權利要求4一種高效敲除熒光假單胞菌(atcc13525)flic基因的方法，其特征在于：
6.根據權利要求4所述的一種高效敲除熒光假單...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李陽，廖俊愷，俞耀威，吳欣曄，吳酬飛，張立欽，吳衡，馮耀宇，
申請(專利權)人：湖州師范學院，
類型：發明
國別省市：
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