【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域，具體涉及一種lull1基因或蛋白為靶點在篩選抑制口蹄疫病毒復制的藥物中的應用。
技術介紹
1、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine?triphosphate，atp)簡稱三磷酸腺苷，被atp酶催化水解為二磷酸腺苷和磷酸根離子，并且釋放能量，是細胞代謝的主要能量來源。lull1(tor1aip2)做為與多種細胞活動相關的atp酶(aaa+atp酶)超家族的成員，屬于torsin家族的成員之一，當其中任何一個atp酶不能正常工作時，都有可能造成嚴重后果。例如，一種叫做torsina的atp酶基因的單個谷氨酸殘基缺失(torsina△e)時將導致常染色體顯性遺傳運動障礙dyt1肌張力障礙。
2、lull1是一個跨膜蛋白，主要定位于內質網(er)，沒有明確的功能基序。已知lull1與lap1(膜相關多肽1)是torsina的激活劑，lull1與lap1都是ii型完整膜蛋白，具有約30kda的管腔結構域，二者具有62％的同源性，torsina和torsinb的活性嚴格依賴于lap1和lull1。lull1這些蛋白的管腔結構域采用aaa樣結構，使它們能夠作為亞基在異六聚體組裝中整合到torsin?atp酶環中。通過這樣做，lap1和lull1將一個關鍵的催化精氨酸殘基貢獻到鄰近的torsin亞基的核苷酸結合口袋中，補充了片段的torsin活性位點，并使atp發生水解，從而參與許多過程，包括蛋白質折疊和降解、細胞骨架動力學、膜運輸、囊泡融合和應激反應等。這種激活機制和生物組裝對于產生具有催化功能的tor
3、口蹄疫病毒(foot-and-mouth?disease?virus,fmdv)會在牛、羊等偶蹄動物中引起高度傳染性疾病，臨床上表現為偶蹄動物口腔粘膜、蹄部和乳房等多處皮膚或無毛部位出現水皰和潰爛癥狀，導致生產力下降喪失。作為小核糖核酸病毒科的一員，fmdv具有約8500個核苷酸的單股正義鏈rna基因組，包含一個大的開放閱讀框。開放閱讀框編碼一個大的多蛋白，由病毒蛋白酶lpro和3cpro共同切割，最后共產生四種結構蛋白(vp1、vp2、vp3和vp4)和八種非結構蛋白(l、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d)。小核糖核酸病毒感染導致胞內膜重新排列成特征囊泡，為病毒rna復制復合體的組裝提供平臺，病毒rna、蛋白質和宿主因子被招募到這些囊泡中來組裝病毒復制復合體。因此探究病毒蛋白與宿主因子之間的相互作用關系，對病毒的致病機理和疫病的防控有非常重要的意義。
4、本專利技術探究lull1對fmdv的作用將主要運用基因編輯技術，基因組編輯是指通過對基因進行定點刪除、修飾或者外源基因定點整合等方法對基因組進行精確修飾。目前crispr/cas9已廣泛應用到科學研究和基因編輯中，作用原理是首先向導rna(sgrna)通過堿基互補配對原則識別靶基因，誘導核酸酶cas9對此位點進行切割從而使雙鍵斷裂，隨后激活細胞基因組自身修復機制，由于核苷酸的缺失或插入等突變，從而造成基因的讀碼框發生改變而出現終止密碼子，基因編碼目的蛋白的功能喪失，達到基因敲除的目的。
技術實現思路
1、針對上述技術問題，專利技術首先確定lull1是口蹄疫病毒復制的關鍵宿主因子。其次構建了重組質粒crispr?v2-lull1-sgrna和plov-lull1，通過慢病毒包裝系統，將病毒液感染pk-15細胞后，使用嘌呤霉素進行篩選，剔除了大量陰性細胞，從而得到了pk-15-lull1-ko細胞系和lull1穩定表達的pk-15細胞系，通過感染fmdv從轉錄水平、蛋白水平、病毒效價三方面探究了lull1對fmdv復制的影響，lull1可以顯著促進fmdv的復制，表明lull1對fmdv的復制具有重要的調控作用，通過進一步探究為病毒-宿主相互作用的機制提供新的見解，為進一步闡明lull1調控fmdv復制機制提供理論依據。具體包括以下內容：
2、第一方面，本專利技術提供了一種lull1基因/蛋白為靶點在制備或篩選用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用；所述藥物以lull1基因/蛋白為靶點，抑制或沉默lull1基因/蛋白的表達。
3、第二方面，本專利技術提供了一種lull1基因/蛋白表達抑制劑在制備用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用。
4、優選地，所述藥物包括以lull1基因/蛋白為靶點設計的小干擾rna；或所述lull1基因/蛋白表達抑制劑包括靶向敲除lull1基因/蛋白的sgrna。
5、優選地，所述sgrna選自plull1-ko-#1-3中的任一種或幾種組合；所述sgrna的序列如下所示：
6、plull1-ko-#1-f：caccggtcccgctgaaacaaattatg；
7、plull1-ko-#1-r：aaaccataatttgtttcagcgggacc；
8、plull1-ko-#2-f：caccgtaagaccagaggcagggtctg；
9、plull1-ko-#2-r：aaaccagaccctgcctctggtcttac；
10、plull1-ko-#3-f：caccgtgtaggcatctgcgacgtggg；
11、plull1-ko-#3-r：aaaccccacgtcgcagatgcctacac。
12、第三方面，本專利技術提供了lull1基因/蛋白敲除細胞系在抗口蹄疫病毒育種中的應用。
13、優選地，所述lull1基因/蛋白敲除細胞系的構建方法包括如下步驟：
14、(1)制備特異性靶向lull1基因/蛋白的sgrna；
15、(2)將步驟(1)制備的sgrna寡聚核苷酸的雙鏈片段插入到表達cas9的慢病毒載體的多克隆位點，轉染細胞得到同時表達cas9蛋白/基因和打靶sgrna序列的重組慢病毒；
16、(3)將步驟(2)制備的重組慢病毒轉導宿主細胞，挑取單個細胞，接種培養，獲得lull1基因/蛋白敲除細胞系。
17、第四方面，本專利技術提供了一種lull1基因/蛋白為靶點在制備或篩選口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生產增效劑中的應用；所述藥物以lull1基因/蛋白為靶點，促進lull1基因/蛋白的表達。
18、第五方面，本專利技術提供了一種lull1蛋白在制備口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生產增效劑中的應用。
19、第六方面，本專利技術提供了一種lull1基因/蛋白過表達細胞系在制備口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生產細胞系中的應用。
20、優選地，所述lull1基因/蛋白過表達細胞系的構建方法包括如下步驟：
21、(1)制備lull1過表達質粒；
22本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.LULL1基因/蛋白為靶點在制備或篩選用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用；所述藥物以LULL1基因/蛋白為靶點，抑制或沉默LULL1基因/蛋白的表達。
2.LULL1基因/蛋白表達抑制劑在制備用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述藥物包括以LULL1基因/蛋白為靶點設計的小干擾RNA；或所述LULL1基因/蛋白表達抑制劑包括靶向敲除LULL1基因/蛋白的sg?RNA。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述sgRNA選自pLULL1-KO-#1-3中的任一種或幾種組合；所述sgRNA的序列如下所示：
5.LULL1基因/蛋白敲除細胞系在抗口蹄疫病毒育種中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述LULL1基因/蛋白敲除細胞系的構建方法包括如下步驟：
7.LULL1基因/蛋白為靶點在制備或篩選口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生產增效劑中的應用；所述藥物以LULL1基因/蛋白為靶點，促進LULL1基因/蛋白的表達。
8.LUL
9.LULL1基因/蛋白過表達細胞系在制備口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生產細胞系中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述LULL1基因/蛋白過表達細胞系的構建方法包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.lull1基因/蛋白為靶點在制備或篩選用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用；所述藥物以lull1基因/蛋白為靶點，抑制或沉默lull1基因/蛋白的表達。
2.lull1基因/蛋白表達抑制劑在制備用于預防或治療口蹄疫病毒感染的藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述藥物包括以lull1基因/蛋白為靶點設計的小干擾rna；或所述lull1基因/蛋白表達抑制劑包括靶向敲除lull1基因/蛋白的sg?rna。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述sgrna選自plull1-ko-#1-3中的任一種或幾種組合；所述sgrna的序列如下所示：
5.lull...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭海學，范許許，李偉偉，王一卓，朱兆宇，裴丹詩，何路，李熙忠，任青峰，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心蘭州分中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。