【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于非天然堿基，具體涉及一種含m3t非天然堿基的體外轉錄方法及其評價分析方法。
技術介紹
1、在自然界中，生物體天然堿基構筑生命活動中的信息存儲和表達體系，實現了生命形式的多樣性。但是用于構筑生命的天然堿基僅有a、t/u、g、c，只能編碼64種密碼子，這限制了核酸分子的化學、結構和功能多樣性，從而限制了核酸分子的生物學應用。非天然堿基技術是從源頭設計、合成、評價和應用的技術體系，新型非天然堿基的發現可豐富核酸分子的化學和結構多樣性、提高遺傳信息的存儲容量、擴展其生物和醫學應用，目前已成為化學生物學一個新的前沿領域。
2、但是非天然堿基技術依然面對諸多的挑戰。首先是具有優良復制和轉錄活性的非天然堿基結構多樣性有限，目前僅有p/z、ds/px、tpt3/nam三類具有代表性的非天然堿基對，非天然堿基化學結構的局限性成為非天然堿基技術生物醫學應用的瓶頸。因此，如何利用氫鍵位移、空間位阻、形狀互補及疏水相互作用等原則設計、合成新型人工堿基對仍然是一項具有挑戰性的任務。其次，不同類型非天然堿基的復制、轉錄、翻譯效率和規律研究不足，缺乏有效的體內外遺傳密碼擴展體系。而有效的體內外遺傳密碼擴展體系是非天然堿基生物醫學應用的關鍵技術，建立非天然堿基基因擴展體系將有利于非天然堿基在基因診斷、功能性核酸分子開發和定點修飾、蛋白藥物改造、防疫、生物傳感等領域的應用和發展。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種含m3t非天然堿基的體外轉錄方法，該體外轉錄方法采用t
2、本專利技術的另一目的在于提供一種針對上述體外轉錄方法獲得的轉錄產物的評價分析方法，該評價分析方法能夠簡單、有效地評價含m3t非天然堿基的短鏈和中長鏈rna轉錄產物的保真度，為m3t核苷rna定點轉錄提供了詳細的依據。
3、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供了以下技術方案：
4、本專利技術提供了一種含m3t非天然堿基的體外轉錄方法，所述體外轉錄方法包括含m3t非天然堿基的短鏈rna體外轉錄方法和含m3t非天然堿基的中長鏈rna體外轉錄方法；
5、所述含m3t非天然堿基的短鏈rna體外轉錄方法包括如下步驟：將含tpt3的非天然堿基轉錄模板與t7啟動子混合反應，獲得雙鏈轉錄模板dna；利用t7?rna聚合酶催化上述雙鏈轉錄模板dna進行體外轉錄反應，轉錄反應結束后，消解轉錄模板dna獲得含m3t非天然堿基的短鏈rna轉錄產物；
6、所述含m3t非天然堿基的中長鏈rna體外轉錄方法包括如下步驟：利用pcr擴增獲得含nam/tpt3非天然堿基對的雙鏈轉錄模板dna；利用t7?rna聚合酶催化上述雙鏈轉錄模板dna進行體外轉錄反應，轉錄反應結束后，消解轉錄模板dna獲得含m3t非天然堿基的中長鏈rna轉錄產物。
7、優選地，所述體外轉錄反應的試劑包括transcription?buffer、ntps、rnaseinhibitor、無機焦磷酸酶、無酶無菌水、rm3ttp。
8、優選地，所述體外轉錄反應的條件為35～37℃反應5～8小時。
9、優選地，所述體外轉錄方法還包括利用含8m尿素5％變性聚丙烯酰胺凝膠對所述短鏈rna轉錄產物或中長鏈rna轉錄產物進行檢測。
10、本專利技術還提供了一種所述的體外轉錄方法獲得的含m3t非天然堿基的rna轉錄產物。
11、本專利技術還提供了一種所述的含m3t非天然堿基的rna轉錄產物的評價分析方法，所述評價分析方法包括含m3t非天然堿基的短鏈rna轉錄產物的保真度評價方法和含m3t非天然堿基的中長鏈rna轉錄產物的保真度評價方法。
12、優選地，所述含m3t非天然堿基的短鏈rna轉錄產物的保真度評價方法包括如下步驟：對獲得的短鏈rna轉錄產物進行純化，采用核酸消化酶將純化后的短鏈rna轉錄產物消解為單核苷；利用高效液相色譜法對消解產物進行檢測，采用單點摩爾濃度校正法對a、t/u、g、c、m3t核苷檢測峰峰面積進行校正，通過各核苷峰面積比例計算轉錄產物核苷組成；以m3t實際檢測比例與理論比例的比值計算m3t核苷的轉錄產物的保真度。
13、優選地，所述含m3t非天然堿基的中長鏈rna轉錄產物的保真度評價方法包括如下步驟：對獲得的中長鏈rna轉錄產物進行純化，利用反轉錄酶對純化后的中長鏈rna轉錄產物進行反轉錄獲得反轉錄pcr產物，將反轉錄pcr產物進行sanger測序，利用tpt3在sanger測序中測序原始信號突然終止的特征判斷m3t非天然堿基中長鏈rna轉錄產物的保真度。
14、優選地，所述評價分析方法還包括對含m3t非天然堿基體外轉錄序列的普適性分析。
15、本專利技術與現有技術相比，具有以下有益效果：
16、(1)本專利技術利用tpt3、nam和m3t非天然堿基系統實現了中長鏈rna中m3t定點轉錄和修飾。即利用nam-tpt3堿基對的高保真復制特性和pcr擴增兼容性擴增獲得含tpt3的雙鏈dna轉錄模板，再基于m3t-tpt3堿基對，在t7?rna聚合酶催化下將m3t引入到中長鏈rna中特定位點。此外，本專利技術驗證發現市售商業化反轉錄酶包括反轉錄酶xl和反轉錄酶m均可識別dtpt3tp催化其與rna中m3t配對，生成在特點位點含tpt3的cdna。本專利技術利用m3t-tpt3的這一特性，針對中長鏈rna中的m3t建立了基于反轉錄的測序分析方法，將rna中的m3t堿基轉化為cdna中的tpt3，進而在cdna的pcr擴增中轉化為雙鏈dna中的tpt3-nam堿基對，利用tpt3-nam堿基對在sanger測序中的測序原始信號突然終止的特征即可判斷中長鏈rna中m3t堿基轉錄保真度，通過對sanger測序結果的分析提示m3t堿基可以實現中長鏈rna的高保真轉錄。
17、(2)本專利技術還通過序列普適性分析發現，m3t核苷轉錄具有序列普適性，在上下游三個隨機序列環境下讀取獲得了所有4096種可能的序列組合。通過對非天然堿基位點上下游核苷組合進行分析，發現了最具轉錄優勢的5’-nnnxtan-3’序列組合形式，同時發現了對轉錄效率可能產生影響的5’-ggnxnnn-3’序列組合形式。以上結果有利于指導m3t核苷rna定點轉錄和修飾時設計轉錄效率更高的模板序列，或者評價特定序列環境下轉錄的可行性，為m3t核苷rna定點轉錄提供了詳細的依據。
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1.一種含m3T非天然堿基的體外轉錄方法，其特征在于，所述含m3T非天然堿基的體外轉錄方法包括含m3T非天然堿基的短鏈RNA體外轉錄方法和含m3T非天然堿基的中長鏈RNA體外轉錄方法；
2.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄的反應試劑包括Transcription?Buffer、NTPs、RNase?inhibitor、無機焦磷酸酶、無酶無菌水、rm3TTP。
3.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄反應的條件為35～37℃反應5～8小時。
4.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄方法還包括利用含8M尿素5％變性聚丙烯酰胺凝膠對所述短鏈RNA轉錄產物或中長鏈RNA轉錄產物進行檢測。
5.權利要求1～4任意一項所述的體外轉錄方法獲得的含m3T非天然堿基的RNA轉錄產物。
6.一種權利要求5所述的含m3T非天然堿基的RNA轉錄產物的評價分析方法，其特征在于，所述評價分析方法包括對含m3T非天然堿基轉錄產物的保真度評價方法和含m3T非天然堿基的中長鏈RNA轉錄
7.根據權利要求6所述的評價分析方法，其特征在于，所述含m3T非天然堿基的短鏈RNA轉錄產物的保真度評價方法包括如下步驟：對獲得的短鏈RNA轉錄產物進行純化，采用核酸消化酶將純化后的短鏈RNA轉錄產物消解為單核苷；利用高效液相色譜法對消解產物進行檢測，采用單點摩爾濃度校正法對A、T/U、G、C、m3T核苷檢測峰峰面積進行校正，通過各核苷峰面積比例計算轉錄產物核苷組成；以m3T實際檢測比例與理論比例的比值計算m3T核苷的轉錄產物的保真度。
8.根據權利要求6所述的評價分析方法，其特征在于，所述含m3T非天然堿基的中長鏈RNA轉錄產物的保真度評價方法包括如下步驟：對獲得的中長鏈RNA轉錄產物進行純化，利用反轉錄酶對純化后的中長鏈RNA轉錄產物進行反轉錄獲得反轉錄PCR產物，將反轉錄PCR產物進行Sanger測序，利用TPT3在Sanger測序中測序原始信號突然終止的特征判斷m3T非天然堿基中長鏈RNA轉錄產物的保真度。
9.根據權利要求6所述的評價分析方法，其特征在于，所述評價分析方法還包括對含m3T非天然堿基體外轉錄序列的普適性分析。
...【技術特征摘要】
1.一種含m3t非天然堿基的體外轉錄方法，其特征在于，所述含m3t非天然堿基的體外轉錄方法包括含m3t非天然堿基的短鏈rna體外轉錄方法和含m3t非天然堿基的中長鏈rna體外轉錄方法；
2.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄的反應試劑包括transcription?buffer、ntps、rnase?inhibitor、無機焦磷酸酶、無酶無菌水、rm3ttp。
3.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄反應的條件為35～37℃反應5～8小時。
4.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述體外轉錄方法還包括利用含8m尿素5％變性聚丙烯酰胺凝膠對所述短鏈rna轉錄產物或中長鏈rna轉錄產物進行檢測。
5.權利要求1～4任意一項所述的體外轉錄方法獲得的含m3t非天然堿基的rna轉錄產物。
6.一種權利要求5所述的含m3t非天然堿基的rna轉錄產物的評價分析方法，其特征在于，所述評價分析方法包括對含m3t非天然堿基轉錄產物的保真度評價方法和含m3t非天然堿基的中長鏈rna轉錄產物的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李凌君，朱吾元，尚林春，王紅磊，朱安蓮，
申請(專利權)人：河南師范大學，
類型：發明
國別省市：
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