【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學檢測，尤其涉及豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測技術。
技術介紹
1、胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus?pleuropneumoniae，app)是豬傳染性胸膜肺炎的主要致病菌，可引發滲出性、纖維性、壞死性和出血性肺炎以及胸膜炎。此疾病發病率和致死率極高，但在大多數病例中呈隱性感染。據報道，臨床表現健康的豬，其上呼吸道仍有病原體寄生，這是造成豬胸膜肺炎放線桿菌傳播的主要原因，也是造成增重率下降，飼料轉化率下降，上市時間延長的主要原因。該致病菌對全球養殖業造成了巨大的經濟損失。盡早診斷亞臨床感染病豬是控制該病的關鍵，但亞臨床感染豬的診斷十分困難。
2、豬胸膜肺炎放線桿菌現在已發現19個血清型，其患病率具有地理差異性，其中，1、5、9、11和12型通常具有很強毒力，而3、6型較為溫和。這種細菌主要寄生于扁桃體和上呼吸道，病原經飛沫或氣霧在短距離內傳播，在體外環境只能存活幾天。app對豬致病有幾個毒力因素，包括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉鐵結合蛋白、蛋白酶、滲透因子及溶血素等，在所有致病因子中最重要的是溶血素(hemolysin,rtx)。app外毒素(actinobacilluspleuropeumoniae-rtx-toxin,apx)對許多細胞，包括巨嗜細胞具有細胞毒性作用。app至少能分泌4種不同型的apx溶血素，即apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ和apxⅳ。其中apxⅰ有較強的溶血活性，apxⅱ溶血活性較弱，apxⅲ僅具有細胞毒性，不具有溶血活性，apxⅳ由所有app血清型在感染豬體中產
3、近年來包括酶聯免疫吸附測定(elisa)、原位雜交、常規pcr、巢式pcr和實時熒光定量pcr等多種分子生物學檢測方法已被開發用于app的診斷檢測。其中各種基于pcr的檢測方法具有較高的敏感性和較好的特異性，在實驗室檢測中應用最為廣泛；但是這些方法需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求，限制了它們在養殖豬場的實際應用。因此，建立一種可鑒別假陰性檢測結果的快速、靈敏、即時檢測、高通量且對儀器要求不高的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒及檢測方法成為目前急需解決的問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組及其應用，以解決如何快速、靈敏、即時檢測、高通量且對儀器要求不高地檢測豬胸膜肺炎放線桿菌的問題。
2、為了達到上述目的本專利技術采用如下技術方案：
3、一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組，包括xerd檢測引物組和內標引物組，所述xerd檢測引物組是以豬胸膜肺炎放線桿菌xerd基因為靶基因的lamp引物組，包括核苷酸序列如seq?id?no.1～2所示的外引物、核苷酸序列如seq?idno.3～4所示的內引物、核苷酸序列如seq?id?no.5～6所示的環引物；所述內標引物組是以豬胸膜肺炎放線桿菌apxiva基因為內標基因的lamp引物，包括核苷酸序列如seq?id?no.7～8所示的外引物、核苷酸序列如seq?id?no.9～10所示的內引物、核苷酸序列如seq?idno.11～12所示的環引物。
4、本專利技術還提供一種所述的可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用。
5、更優地，所述檢測試劑盒包括所述的xerd檢測引物組、內標引物組、lamp反應液、bst?dna聚合酶、10×sybr?green?i、陽性對照、陰性對照和內標。
6、更優地，所述陽性對照是含有豬胸膜肺炎放線桿菌xerd基因部分片段的t載體克隆；所述內標是含有apxiva基因部分片段的t載體克隆，所述陰性對照是超純水。
7、更優地，所述內標濃度為內標引物組的最低檢出限1fg/μl。
8、更優地，所述lamp反應液包括6-8mm?dntp、10×thermopol反應緩沖液、120-160mmmgso4水溶液、三者的體積比是8：4：3。
9、更優地，利用xerd檢測引物組構建的恒溫擴增反應體系及條件，25μl反應體系含有：seq?id?no.1所示引物xerd-f30.2μm，seq?id?no.2所示引物xerd-b30.2μm，seq?idno.3所示引物xerd-fip?3.2μm，seq?id?no.4所示引物xerd-bip?3.2μm，seq?id?no.5所示引物xerd-lf?1.6μm，seq?id?no.6所示引物xerd-lb?1.6μm，lamp反應液12.5μl，bst?dna聚合酶8u，10×sybr?green?i?0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補齊到25μl；設置陰性對照和陽性對照；
10、lamp恒溫擴增的程序為：63～65℃反應30～60min，并在80℃持續2min；
11、利用內標引物組構建恒溫擴增內標反應體系及條件，25μl反應體系含有：seq?idno.7所示引物apxiva-f30.2μm，seq?id?no.8所示引物apxiva-b30.2μm，seq?id?no.9所示引物apxiva-fip?3.0μm，seq?id?no.10所示引物apxiva-bip?3.0μm，seq?id?no.11所示引物apxiva-loopf1.6μm，seq?id?no.12所示apxiva-loopb?1.6μm，lamp反應液12.5μl，bstdna聚合酶8u，10×sybr?green?i?0.5μl，待檢樣品2μl，內標2μl，用超純水補齊到25μl；設置陰性對照；
12、lamp恒溫擴增的程序為：63～65℃反應30～60min，并在80℃持續2min；
13、反應結束后根據xerd基因檢測結果和內標基因apxiva檢測結果進行判斷：
14、xerd基因檢測結果為陽性、內標基因檢測結果全為陽性時，檢測結果為陽性；
15、xerd基因檢測結果為陰性、內標基因檢測結果全為陽性時，檢測結果為陰性；
16、xerd基因檢測結果為陽性、內標基因檢測結果全為陰性時，檢測結果為陽性；
17、xerd基因檢測結果為陰性、內標基因檢測結果全為陰性時，檢測結果可能為假陰性，建議重新提取dna進行檢測。
18、本專利技術與現有技術相比具有以下優點：
19、恒溫擴增技術具有檢測時間本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組，其特征在于：
2.一種權利要求1所述的可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用。
3.根據權利要求2所述一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
5.根據權利要求4所述的一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
6.根據權利要求4所述的一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
7.根據權利要求5所述的一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
【技術特征摘要】
1.一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組，其特征在于：
2.一種權利要求1所述的可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用。
3.根據權利要求2所述一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測試劑盒中的應用，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的一種可避免假陰性檢測結果的豬胸膜肺炎放線桿菌恒溫檢測引物組在制備檢測...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹煒偉，黃百祺，劉助紅，梁寶霞，續倩，謝文敏，
申請(專利權)人：廣東科貿職業學院，
類型：發明
國別省市：
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