【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病害鑒定，具體涉及一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法。
技術介紹
1、香榧的種仁富含優質脂肪酸、蛋白質及多種微量元素，具有極高的營養價值，尤其是其堅果部分，具有獨特的風味，受到市場的廣泛歡迎。
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4、盡管香榧在市場上展現出了巨大的經濟潛力，但其種植和加工過程中存在的病害問題，尤其是香榧黑斑病，已成為影響香榧品質和產量的主要因素之一。香榧樹的生長過程中，病蟲害的發生嚴重影響了香榧的外觀質量和食用價值，甚至可能導致產量的顯著下降。黑斑病作為香榧生產中的一種常見病害，已成為影響香榧品質的主要因素之一，尤其是在加工過程中，對香榧的外觀和口感造成了極大的損害。
5、香榧的生產過程中，采摘的時機、后熟處理的方式以及氣候條件等因素都可能影響病害的發生。具體來說，香榧的后熟期(即青蒲階段)是病害高發期。在后熟過程中，由于香榧果實內外環境的濕度較高，容易滋生各類病原菌，導致種殼表面出現霉斑、黑斑等問題。此外，由于香榧種仁和種衣的特殊成分——如單寧等，這使得香榧種子對病原菌的感染具有一定的易感性，進一步加劇了香榧的病害發生。
6、目前，香榧黑斑病的發生常常伴隨著種仁腐爛、空心籽等現象的發生，嚴重影響香榧的外觀和品質。這不僅影響了香榧的市場競爭力，也使得種植者面臨著巨大的經濟損失。在一些地區，由于缺乏有效的防治措施，黑斑病的發生已經成為香榧產業發展中的瓶頸問題。
7、香榧黑斑病的典型癥狀表現為果實表面出現黑色斑點，這些斑點通常為圓形或不規則形狀，且隨著病害的發
8、香榧黑斑病的發生不僅影響果實外觀，還可能導致香榧的種仁質量降低。由于香榧種仁內含大量的脂肪和蛋白質，受到病害的侵染后，這些營養成分可能被病原菌降解，造成種仁軟腐、發霉或空心籽的現象，進一步降低其食用價值和商業價值。黑斑病還會導致香榧的炒制加工過程變得更加復雜，增加了生產成本和加工難度。
9、盡管香榧黑斑病已成為影響香榧品質的主要病害之一，但目前針對該病害的系統研究仍相對匱乏。國內外關于香榧病害的研究大多集中于栽培管理、栽培環境的優化等方面，而對香榧黑斑病的具體病原菌、發病機制及防治措施的研究較為薄弱，尤其是在病原菌鑒定與致病機理方面，現有研究尚未給出明確的答案。
10、在香榧病害的研究中，關于黑斑病的病原菌并未得到足夠的關注?，F有文獻大多沒有對香榧黑斑病的病原進行系統的鑒定和分類，導致了病害防治工作的盲目性與不確定性。雖然一些研究表明，香榧黑斑病可能與霉菌、細菌等微生物的感染有關，但具體的病原菌種類及其致病機制仍然不清楚。此外，現有的防治技術也多停留在簡單的農藥噴灑和物理防治等層面，缺乏基于病原菌特性的精準防治措施。
11、基于上述背景，本申請提供了一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，用以快速分離、鑒定病原菌。
技術實現思路
1、本專利技術的目的就在于為了解決上述問題而提供一種結構簡單，設計合理的香榧黑斑病病原菌的鑒定方法。
2、本專利技術通過以下技術方案來實現上述目的：
3、一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，該方法包括以下步驟，
4、步驟s102，獲得香榧感病黑斑籽；
5、基于種殼和種衣進行組織分離法獲得病原菌菌株；
6、獲得病原菌形態鑒定數據；
7、步驟s104，獲得病原菌的rdna-its、tub和tef基因序列特征，獲得病原菌的鑒定結果；
8、步驟s106，基于病原菌的生物特性，獲得病原菌的生物學特性；
9、其中，所述生物學特性包括適宜溫度值、適宜ph值以及適合的碳氮源。
10、作為本專利技術的進一步優化方案，獲得病原菌菌株，于預設頻率下分離種殼和種衣，活化后于菌落邊緣取直徑5mm菌餅，接種到不同處理培養基平板中央，每皿1片，每處理重復3皿，25℃恒溫培養箱中培養2d，采用十字交叉法測量菌落直徑，獲得菌落的形態特征；對試驗數據進行單因子方差分析，并進行差異顯著性檢測。
11、作為本專利技術的進一步優化方案，種殼和種衣分離頻率分別為76.92％和60％。
12、作為本專利技術的進一步優化方案，獲得病原菌菌株，采用組織分離法對病原菌進行分離以及純化，將種籽外殼用75％乙醇進行表面消毒，無菌水沖洗3次后，在黑斑處切取大小為5×5mm左右的種殼和種衣組織塊，置于pda培養基上，25℃培養，以預設次數純化，獲得編號為xfhk3的病原菌。
13、作為本專利技術的進一步優化方案，將純化的菌株接種于pda培養基上，25℃培養，觀察記錄菌落的顏色、形態、表面特征，并記錄分生孢子顏色、大小，獲得xfhk3病原菌的形態學數據。
14、作為本專利技術的進一步優化方案，獲得燕麥枝條碎粒培養基，于燕麥枝條碎粒培養基內25℃光暗交替培養，對分離菌株進行產孢誘導，再挑取分生孢子器于載玻片上壓破后采集孢子的形態學數據。
15、作為本專利技術的進一步優化方案，采集健康、潔凈的香榧種籽，用75％乙醇進行表面消毒，再用無菌水沖洗干凈，將處理好的種籽置于鋪有保濕無菌濾紙的培養皿中，用打孔器從培養的菌落上打取菌餅，將菌餅貼至香榧種殼中部，以pda培養基塊做對照，每個重復9個種籽，每種處理3個重復，持續觀察種籽是否感病及發病癥狀并做好記錄，最后，對接種病原菌的種籽再次分離發病組織，獲得分離菌的致病性數據。
16、作為本專利技術的進一步優化方案，將純化的菌株接種于pda培養基上培養，收集菌絲體，采用ezup柱式真菌基因組dna抽提取試劑盒提取分離純化的致病菌株的dna，首先選擇引物its1/its4對its基因擴增，比對后初步確定病原菌種屬，再進一步選取引物bt2a/bt2b和ef1-688f/ef1-986r對菌株的tub和tef基因進行pcr擴增，獲得測序結果并進行同源性比對分析，比對獲得序列，剪切后將多基因拼接構建系統發育樹。
17、作為本專利技術的進一步優化方案，獲得通用引物its1/its4對選擇的代表菌株xfhk3進行pcr擴增，序列測定后將獲得的序列比對，并根據擴增的各菌株特異保守序列分子序列進行多重序列比對，構建分子系統發育樹，完成對病原菌xfhk3的鑒定。
18、本專利技術的有益效果在于：
19、本專利技術通過組織分離法獲得病原菌菌株，對病原菌進行了形態鑒定，經柯赫氏法則對病菌的致病性進行驗證，分析其rdna-its、tef和tub基因序列特征，以期明確香榧黑斑病的致病菌，為香榧黑斑病的發病規律及防控措施的制定提供理論依據。
20、本專利技術提供的香榧黑斑病病原菌的特異引物，為病原菌的快速、準確鑒定提供可行方案；采用特異引物對菌落進行確認，可以快速鑒別病原菌。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟，
2.根據權利要求1所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：通過組織分離法，分離種殼和種衣，獲得病原菌菌株，活化后于菌落邊緣取直徑5mm菌餅，接種到不同處理培養基平板中央，每皿1片，每處理重復3皿，25℃恒溫培養箱中培養2d，采用十字交叉法測量菌落直徑，獲得菌落的形態特征；對試驗數據進行單因子方差分析，并進行差異顯著性檢測。
3.根據權利要求2所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：該種菌在種殼和種衣分離頻率分別為76.92％和60％。
4.根據權利要求2所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：獲得病原菌菌株，采用組織分離法對病原菌進行分離以及純化，將種籽外殼用75％乙醇進行表面消毒，無菌水沖洗3次后，在黑斑處切取大小為5×5mm左右的種殼和種衣組織塊，置于PDA培養基上，25℃培養，以預設次數純化，獲得編號為XFHK3的病原菌。
5.根據權利要求4所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：將純化的菌株接種于PDA培養基上，25
6.根據權利要求5所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：獲得燕麥枝條碎粒培養基，于燕麥枝條碎粒培養基內25℃光暗交替培養，對分離菌株進行產孢誘導，再挑取分生孢子器于載玻片上壓破后采集孢子的形態學數據。
7.根據權利要求1所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：采集健康、潔凈的香榧種籽，用75％乙醇進行表面消毒，再用無菌水沖洗干凈，將處理好的種籽置于鋪有保濕無菌濾紙的培養皿中，用打孔器從培養的菌落上打取菌餅，將菌餅貼至香榧種殼中部，以PDA培養基塊做對照，每個重復9個種籽，每種處理3個重復，持續觀察種籽是否感病及發病癥狀并做好記錄，最后，對接種病原菌的種籽再次分離發病組織，獲得分離菌的致病性數據。
8.根據權利要求1所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：將純化的菌株接種于PDA培養基上培養，收集菌絲體，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提取試劑盒提取分離純化的致病菌株的DNA，首先選擇引物ITS1/ITS4對ITS基因擴增，比對后初步確定病原菌種屬，再進一步選取引物Bt2a/Bt2b和EF1-688F/EF1-986R對菌株的TUB和TEF基因進行PCR擴增，獲得測序結果并進行同源性比對分析，比對獲得序列，剪切后將多基因拼接構建系統發育樹。
9.根據權利要求8所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：獲得通用引物ITS1/ITS4對選擇的代表菌株XFHK3進行PCR擴增，序列測定后將獲得的序列比對，并根據擴增的各菌株特異保守序列分子序列進行多重序列比對，構建分子系統發育樹，完成對病原菌XFHK3的鑒定。
...【技術特征摘要】
1.一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟，
2.根據權利要求1所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：通過組織分離法，分離種殼和種衣，獲得病原菌菌株，活化后于菌落邊緣取直徑5mm菌餅，接種到不同處理培養基平板中央，每皿1片，每處理重復3皿，25℃恒溫培養箱中培養2d，采用十字交叉法測量菌落直徑，獲得菌落的形態特征；對試驗數據進行單因子方差分析，并進行差異顯著性檢測。
3.根據權利要求2所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：該種菌在種殼和種衣分離頻率分別為76.92％和60％。
4.根據權利要求2所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：獲得病原菌菌株，采用組織分離法對病原菌進行分離以及純化，將種籽外殼用75％乙醇進行表面消毒，無菌水沖洗3次后，在黑斑處切取大小為5×5mm左右的種殼和種衣組織塊，置于pda培養基上，25℃培養，以預設次數純化，獲得編號為xfhk3的病原菌。
5.根據權利要求4所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：將純化的菌株接種于pda培養基上，25℃培養，觀察記錄菌落的顏色、形態、表面特征，并記錄分生孢子顏色、大小，獲得xfhk3病原菌的形態學數據。
6.根據權利要求5所述的一種香榧黑斑病病原菌的鑒定方法，其特征在于：獲得燕麥枝條碎粒培養基，于燕麥枝條碎粒培養基內25℃光暗交替培養，對分離菌株...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡淵淵，宋麗麗，吳家勝，喻衛武，劉濤，葉浩杰，賴思思，謝凌皓，方南壽，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：
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