本發(fā)明專利技術(shù)屬于細胞工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種實現(xiàn)草食家畜卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法及應(yīng)用，所述實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法包括：靶向卵母細胞基因編輯的sgRNA的制備；卵母細胞的胞質(zhì)顯微共注射；基因編輯卵母細胞的體外受精和檢測。本發(fā)明專利技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對草食家畜卵母細胞單等位基因進行精準(zhǔn)刪除。本發(fā)明專利技術(shù)保護一種特異性敲除卵母細胞基因的方法，是將所述能夠特異的靶向修飾卵母細胞基因的sgRNA和Cas9mRNA共轉(zhuǎn)染卵母細胞，從而敲除卵母細胞基因；所述共轉(zhuǎn)染的方式具體可為顯微共注射；所述卵母細胞具體可為綿羊卵母細胞，所述卵母細胞共注射的時間可以是體外成熟20h。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于細胞工程和基因工程，尤其涉及一種實現(xiàn)綿羊卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、crispr/cas9系統(tǒng)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源dna。而crispr/cas9基因編輯技術(shù)，則是對靶向基因進行特定dna修飾的技術(shù)。該基因編輯技術(shù)系統(tǒng)主要由cas9核酸酶和sgrna組成。cas9核酸酶具有切割雙鏈dna的活性結(jié)構(gòu)域，使得雙鏈dna斷裂(dsb)；sgrna是由起支架功能的tracrrna與特異性的crrna結(jié)合形成的嵌合rna。sgrna通過rna-dna堿基互補配對將cas9/sgrna復(fù)合物靶向募集到目的基因，cas9再通過識別目的基因上的pam基序(5’-ngg-3’)定點切割雙鏈dna，進而對目的基因起到編輯作用。
2、自2014年以來，新疆畜牧科學(xué)院生物工程研究所應(yīng)用受精卵顯微注射技術(shù)和cas9/sgrna基因編輯技術(shù)靶向編輯綿羊受精卵，獲得了上百只基因編輯綿羊，是目前國內(nèi)少數(shù)幾個能進行大規(guī)模綿羊胚胎體外生產(chǎn)，胚胎移植和綿羊基因組編輯育種的實驗室之一。編輯的靶基因多為與繁殖，產(chǎn)肉，毛色和毛長等重要的功能基因，例如成纖維生長因子5(fibroblast?growth?factor,fgf5)，對綿羊和駱駝等產(chǎn)毛量和毛長密切相關(guān)。但在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，一些重要功能基因的刪除，修飾可能會影響胚胎的發(fā)育和妊娠率，甚至造成胚胎的發(fā)育異常，從而引發(fā)流產(chǎn)。因此只對卵母細胞進行單等位基因刪除對胚胎發(fā)育和基因功能的研究具有重要的意義。</p>
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)提供了一種實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法及應(yīng)用。
2、本專利技術(shù)是這樣實現(xiàn)的，一種實現(xiàn)草食家畜卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，所述實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法包括以下步驟：
3、步驟一，靶向卵母細胞基因編輯的sgrna的制備；
4、步驟二，卵母細胞的體外成熟和胞質(zhì)顯微共注射；
5、步驟三，基因編輯卵母細胞的體外受精和檢測。
6、進一步，步驟一中，所述sgrna的制備，包括：
7、(1)bbsⅰ單酶切質(zhì)粒42230cas9質(zhì)粒濃度510ug/ml?od＝1.83；10×fastdigestbuffer2、cas9質(zhì)粒0.8、fastdigest?enzyme?1、ddh2o?16.2，共計20ul；37℃酶切2h，酶切產(chǎn)物電泳，切膠，qiagen試劑盒膠回收，用30ul?nuclease-free?water過柱洗脫；
8、(2)引物退火，cf71、cr71、10×buffera?2、ddh2o?16，共計20ul；95度5min，0.1度/s冷卻至室溫；
9、(3)將線性化質(zhì)粒和退火后的產(chǎn)物連接，solutionⅰ5ul、質(zhì)粒2、退火后的引物1、ddh2o?2，共計10ul；16度連接1h；
10、(4)轉(zhuǎn)化dh5α，涂amp+平板，dh5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，每只100ul，在冰上慢慢解凍，取5μl連接產(chǎn)物加入50μl?dh5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，用手指輕輕彈摸混勻后，放冰上30min；
11、(5)挑取平板上的單菌落，進行菌落pcr驗證，10×buffer2.5ul、dntp2、tf7或cf70.5ul、tr70.5ul、模板1ul、taqe?0.125ul、ddh2o?18.375ul、共計25ul；pcr程序：94℃4min；94℃30s、55℃30s、72℃30s、72℃10min；2.0％的瓊脂凝膠電泳，產(chǎn)物大小100bp；
12、(6)對驗證正確的質(zhì)粒或pcr產(chǎn)物擴增，標(biāo)號，并送測序；用質(zhì)粒進行pcr擴增；primestar?max?premix(2×)25ul、tf70.5ul、tr70.5ul、template0.5ul、ddh2o?23.5ul，共計50ul；thermo的taq酶擴增；用qiagen?pcr產(chǎn)物純化試劑盒純化后用作轉(zhuǎn)錄模板；
13、(7)用mega?shortscripttm?kit做體外轉(zhuǎn)錄；t710×reactionbuffer2ul、t7?atpsolution?2ul+c+g+u各2ul，混勻為8ul、template?dna?8ul、t7?enzyme?mix2ul、共計20ul；incubate?the?reaction?at?37℃?for?at?least?2h，最好3h以上；
14、(8)轉(zhuǎn)錄后用megacleartm?kit試劑盒純化；先96度預(yù)熱200ul?elution?solution，最后進行電泳檢測和冷凍保。
15、本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種特異性敲除卵母細胞基因的方法，所述特異性敲除卵母細胞基因的方法，包括：
16、將所述能夠特異的靶向修飾卵母細胞基因的sgrna和cas9?mrna共轉(zhuǎn)染卵母細胞，從而敲除卵母細胞基因。
17、進一步，所述共轉(zhuǎn)染的方式為共注射。
18、進一步，所述卵母細胞可以為綿羊卵母細胞，所述綿羊卵母細胞共注射的時間是體外成熟20h。
19、本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中的應(yīng)用。
20、本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種所述特異性敲除卵母細胞基因的應(yīng)用方法，所述特異性敲除卵母細胞基因的應(yīng)用方法，包括：
21、(1)將px330質(zhì)粒經(jīng)bbsi酶切，得到酶切載體，將退火所得的目的基因sgrna與酶切載體連接，得到重組質(zhì)粒；
22、(2)將所述步驟(1)中的目的基因sgrna還可以是靶向fgf5基因編輯的mrna；
23、(3)以所述步驟(2)得到的sgrna重組質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)錄、純化得到用于顯微注射的fgf5-sgrna；
24、(4)將所述步驟(3)得到的fgf5-sgrna和cas9蛋白共注射卵母細胞，實現(xiàn)sgrna靶向編輯卵母細胞基因編輯。
25、進一步，步驟(4)中，所述fgf5-sgrna的濃度是50ng/μl，所述cas9蛋白的濃度是100ng/μl。
26、進一步，所述cas9蛋白/sgrna顯微注射的卵母細胞可以是體外成熟培養(yǎng)20h的卵母細胞。
27、進一步，所述cas9蛋白/sgrna還可以與ssodn共注射卵母細胞，實現(xiàn)卵母細胞靶基因的hdr精準(zhǔn)編輯。
28、結(jié)合上述的所有技術(shù)方案，本專利技術(shù)所具備的優(yōu)點及積極效果為：本專利技術(shù)提供的實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對卵母細胞單等位基因進行精準(zhǔn)刪除。本專利技術(shù)保護一種特異性敲除卵母細胞基因的方法，是將所述能夠特異的靶向修飾卵母細胞基因的sgrna和cas9?mrna共轉(zhuǎn)染細胞，從而敲除卵母細胞基因。所述共轉(zhuǎn)染的方式具體可為共注射。所述卵母細胞具體可為綿羊卵母細胞和駱駝卵母細胞，所述卵母細胞共注射的時間可本文檔來自技高網(wǎng)
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【技術(shù)保護點】
1.一種實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，其特征在于，所述實現(xiàn)卵母細胞主要是草食家畜等大動物卵母細胞，單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，其特征在于，步驟一中，所述sgRNA的制備，包括：
3.一種特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述特異性敲除卵母細胞基因的方法，包括：
4.如權(quán)利要求3所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)染的方式為共注射。
5.如權(quán)利要求3所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述卵母細胞可以為綿羊卵母細胞，也可以是駱駝卵母細胞，所述卵母細胞共注射的時間可以是體外成熟20h。
6.一種如權(quán)利要求3～5任意一項所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求6所述特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中的應(yīng)用方法，其特征在于，所述特異性敲除卵母細胞基因的應(yīng)用方法，包括：
8.如權(quán)利要求7所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中的應(yīng)用方法，其特征在于，步驟(4)中，所述FGF5-sgRNA的濃度是50ng/μl，所述Cas9蛋白的濃度是100ng/μl。
9.如權(quán)利要求8所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中的應(yīng)用方法，其特征在于，所述Cas9蛋白/sgRNA顯微注射的卵母細胞可以是體外成熟培養(yǎng)20h的卵母細胞。
10.如權(quán)利要求8所述的特異性敲除卵母細胞基因的應(yīng)用方法，其特征在于，所述Cas9蛋白/sgRNA還可以與ssODN共注射卵母細胞，實現(xiàn)卵母細胞靶基因的HDR精準(zhǔn)編輯。
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【技術(shù)特征摘要】
1.一種實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，其特征在于，所述實現(xiàn)卵母細胞主要是草食家畜等大動物卵母細胞，單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的實現(xiàn)卵母細胞單等位基因精準(zhǔn)編輯的方法，其特征在于，步驟一中，所述sgrna的制備，包括：
3.一種特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述特異性敲除卵母細胞基因的方法，包括：
4.如權(quán)利要求3所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)染的方式為共注射。
5.如權(quán)利要求3所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法，其特征在于，所述卵母細胞可以為綿羊卵母細胞，也可以是駱駝卵母細胞，所述卵母細胞共注射的時間可以是體外成熟20h。
6.一種如權(quán)利要求3～5任意一項所述的特異性敲除卵母細胞基因的方法在精準(zhǔn)編輯卵母細胞基因中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彭新榮，李文蓉，韓冰，劉晨曦，鄭志強，陳雷，陳鋼糧，
申請(專利權(quán))人：新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所新疆畜牧科學(xué)院中國澳大利亞綿羊育種研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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