【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子標記技術(shù)開發(fā)及應用，尤其是一種基于四角蛤蜊有參轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的ssr分子標記、擴增引物及應用。
技術(shù)介紹
1、四角蛤蜊(mactra?veneriformis)隸屬于瓣鰓綱(lamellibranchia)，異齒亞綱(heterodonta)，簾蛤目(veneroida)，蛤蜊科(mactridae)，蛤蜊屬(mactra)，俗稱白蜆子，沙蛤、沙蜊、白蛤，是中國主要的經(jīng)濟貝類之一，營埋棲性生活，主要分布潮間帶中下區(qū)及淺海的泥沙灘中，分布于中國、韓國、日本，在我國以天津、遼寧、山東、江蘇沿海產(chǎn)量較多。因其味道鮮美、營養(yǎng)價值高，如高蛋白，低脂肪，富含不飽和脂肪酸等優(yōu)點，深受消費者的喜愛。近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展，圍海造陸規(guī)模在部分沿海城市逐漸擴大，灘涂貝類的產(chǎn)卵場收到極大的影響，在一定程度上導致四角蛤蜊等灘涂貝類資源的減少，因此急需闡明四角蛤蜊種群資源背景，為四角蛤蜊新品種的培育奠定基礎。
2、微衛(wèi)星標記(ssr)是一類重要的分子標記，目前開發(fā)的方法主要有兩種，一種是傳統(tǒng)的基因組開發(fā)方法(genomic?ssr，g-ssr)，一種是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的est-ssr，即表達序列標簽-ssr(expressed?sequence?tag)開發(fā)方法。與傳統(tǒng)的基因組ssr開發(fā)技術(shù)相比，基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)所開發(fā)的數(shù)量豐富、開發(fā)成本低和開發(fā)周期短，且重要的是，常常與重要經(jīng)濟性狀如生長等功能基因關(guān)聯(lián)，在水產(chǎn)經(jīng)濟動物多態(tài)性的研究中具有要的價值。目前海洋酸化極大影響了海洋生物尤其是貝類的生存和生長，四角蛤蜊在作為在幼蟲
3、目前，現(xiàn)有技術(shù)中有時會采用傳統(tǒng)的基因組ssr開發(fā)方法(genomic?ssr，g-ssr)，一般采用磁珠富集法進行開發(fā)，操作步驟繁瑣，價格高昂。并且開發(fā)出的ssr標記大部分與重要的經(jīng)濟性狀不相關(guān)，在育種中的價值不大。基于轉(zhuǎn)錄組的ssr開發(fā)技術(shù)與傳統(tǒng)的基因組ssr開發(fā)技術(shù)相比，所開發(fā)ssr的數(shù)量豐富、成本低、開發(fā)周期較短，且重要的是，用這種方法開發(fā)的ssr標記常常與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)聯(lián)，在水產(chǎn)經(jīng)濟動物多態(tài)性的研究中具有非常重要的價值。但目前用于四角蛤蜊種群遺傳學分析和育種的分子標記極少，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的ssr在四角蛤蜊中還未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于四角蛤蜊有參轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的ssr分子標記、擴增引物及應用。
2、本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
3、一種基于四角蛤蜊有參轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的ssr分子標記，所述ssr分子標記包括16個微衛(wèi)星標記mv01、mv05、mv09、mv12、mv13、mv16、mv18、mv20、mv22、mv30、mv42、mv43、mv45、mv70、mv71、mv72，其對應的核苷酸序列依次如seq?id?no.1-seq?id?no.16所示。
4、如上所述的ssr分子標記的擴增引物，所述擴增引物包括16個擴增引物對，其對應的核苷酸序列依次如seq?id?no.17-seq?id?no.48所示。
5、如上所述ssr分子標記的獲取方法，包括如下步驟：
6、(1)進行針對四角蛤蜊酸化組和對照組高通量轉(zhuǎn)錄組測序，并以前期進行的全基因組測序為參考序列，組裝出高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組序列；在獲得的轉(zhuǎn)錄組序列中，原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)trinity軟件組裝并去除冗余后，獲得了平均長度為2017.11bp的unigenes?25145條；
7、(2)微衛(wèi)星標記篩選和引物設計
8、微衛(wèi)星序列的識別和定位使用misa軟件進行，misa搜索參數(shù)設置如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重復次數(shù)分別為12、6、5、5、4和4，復合ssr兩個位點間最大間隔堿基數(shù)設置為100，結(jié)合primerpremier?5軟件設計引物；主要參數(shù)設置：引物長度為18～25bp，pcr擴增產(chǎn)物長度在150～300bp之間，52℃≤退火溫度tm≤65℃，20％≤gc含量≤80％；同時，利用ncbi數(shù)據(jù)庫中的primer-blast對結(jié)果進行進一步驗證，主要參數(shù)設置為：selfcomplementarity<6，self′3complementarity<3，且上下游引物tm值差值不高于2℃。最終篩選出90對引物；
9、(3)以四角蛤蜊提取的dna為模板，對上述90對引物進行pcr擴增，pcr反應體系為20μl，其中包括：100ng模板dna，2μl?10×buffer，10m?m含mg2+的dntp?1μl，正向引物f和反向引物r各1μl，1u?taq?dna聚合酶；pcr反應程序為95℃預變性3min；94℃變性45s，50-60℃退火30s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)；得到的pcr產(chǎn)物采用毛細管凝膠電泳法通測序分析儀進行分析，最終得到16個條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記。
10、如上所述的ssr分子標記在四角蛤蜊不同群體遺傳多樣性分析中的應用。
11、如上所述的ssr分子標記在四角蛤蜊親緣關(guān)系鑒定中的應用。
12、如上所述的ssr分子標記在四角蛤蜊高密度遺傳圖譜構(gòu)建中的應用。
13、如上所述的ssr分子標記在四角蛤蜊分子標記輔助育種中的應用。
14、本專利技術(shù)取得的優(yōu)點和積極效果為：
15、1、目前未見有從基因組和轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)四角蛤蜊微衛(wèi)星的報道，本專利技術(shù)首次基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，從四角蛤蜊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中開發(fā)出16個穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性高的分子標記，為四角蛤蜊種群遺傳學分析、親緣關(guān)系鑒定、高密度遺傳圖譜構(gòu)建及分子標記輔助育種領(lǐng)域，具有良好的實際生產(chǎn)和應用價值。
16、2、本專利技術(shù)首次建立一種基于四角蛤蜊高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)ssr標記的方法，利用前期高通量測序得到的有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，進行ssr標記的篩查，開發(fā)高效、準確的ssr的位點。篩選了16個穩(wěn)定、可靠，重復性好，準確性高的est-ssr標記。將此16個微衛(wèi)星標記應用于四角蛤蜊4個地理種群中進行遺傳多樣性分析，能夠準確的進行不同地理群體的聚類，并顯示出較高的多態(tài)性。說明本說明開發(fā)的微衛(wèi)星標記能夠用于四角蛤蜊的種群遺傳學分析、親緣關(guān)系鑒定、高密度遺傳圖譜構(gòu)建及分子標記輔助育種領(lǐng)域，會極大推動四角蛤蜊種質(zhì)資源評價，遺傳育種工作的進展。
17、3、本專利技術(shù)首次建立一種基于四角蛤蜊高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)ssr標記的方法，篩選穩(wěn)定、可靠，重復性好，準確性高的ssr標記，用于四角蛤蜊的種群遺傳學分析、親緣關(guān)系鑒定、高密度遺傳圖譜構(gòu)建及分子標記輔助育種領(lǐng)域，將會極大推動四角蛤蜊種質(zhì)資源評價，遺傳育種工作的進展。
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1.一種基于四角蛤蜊有參轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的SSR分子標記，其特征在于：所述SSR分子標記包括16個微衛(wèi)星標記Mv01、Mv05、Mv09、Mv12、Mv13、Mv16、Mv18、Mv20、Mv22、Mv30、Mv42、Mv43、Mv45、Mv70、Mv71、Mv72，其對應的核苷酸序列依次如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.16所示。
2.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記的擴增引物，其特征在于：所述擴增引物包括16個擴增引物對，其對應的核苷酸序列依次如SEQ?ID?NO.17-SEQ?ID?NO.48所示。
3.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記的獲取方法，其特征在于：包括如下步驟：
4.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記在四角蛤蜊不同群體遺傳多樣性分析中的應用。
5.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記在四角蛤蜊親緣關(guān)系鑒定中的應用。
6.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記在四角蛤蜊高密度遺傳圖譜構(gòu)建中的應用。
7.如權(quán)利要求1所述的SSR分子標記在四角蛤蜊分子標記輔助育種中的應用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于四角蛤蜊有參轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的ssr分子標記，其特征在于：所述ssr分子標記包括16個微衛(wèi)星標記mv01、mv05、mv09、mv12、mv13、mv16、mv18、mv20、mv22、mv30、mv42、mv43、mv45、mv70、mv71、mv72，其對應的核苷酸序列依次如seq?id?no.1-seq?id?no.16所示。
2.如權(quán)利要求1所述的ssr分子標記的擴增引物，其特征在于：所述擴增引物包括16個擴增引物對，其對應的核苷酸序列依次如seq?...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳麗梅，黃庚胤，王墨染，張丹，郭永軍，
申請(專利權(quán))人：天津農(nóng)學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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