【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種唾液和外泌體mir-185的絕對定量方法，該方法主要用于口腔白斑癌變和口腔癌的早期診斷。
技術介紹
1、口腔癌是世界上最常見的10種癌癥之一，占頭頸部惡性腫瘤的80％，每年新增35萬余例，發病率4/10萬，其中以口腔鱗狀細胞癌(oral?squamous?cell?carcinoma,oscc)多見，其五年生存率約為35-57％，每年約有13萬口腔癌患者死亡[1-3]。近年來，口腔癌發病率有增高及明顯年輕化的趨勢。盡管對口腔癌的外科手術、放療及化療技術在不斷進步，但患者的5年存活率仍然不到50％。其中晚期患者發生轉移者，5年生存率僅20％[4]，對口腔癌進行早期診斷并及時治療，5年生存率可提高至80％。
2、口腔潛在惡性疾患(oral?potentially?malignant?disorders,opmds)是一組發生在口腔鱗狀細胞癌之前的疾病，包括口腔白斑、紅斑、增殖性疣狀白斑病、口腔黏膜下纖維性變、口腔扁平苔蘚、紅斑狼瘡、先天性角化不全癥、苔蘚樣變等，患這類疾病的患者發生口腔癌的風險增高[5]。其中口腔白斑被公認為口腔斑紋疾病中最典型的口腔潛在惡性疾患之一，其癌變率高達10-36％。
3、口腔白斑(oral?leukoplakia，olk)也稱為口腔黏膜白斑，是由匈牙利皮膚科醫生er?no?sohuimmer于1887年首先命名，是指發生于口腔黏膜上的白色或灰白色角化異常性病變。口腔白斑常見于中老年人群,好發于唇、頰、舌、腭等黏膜上,一般無自覺癥狀,初起時呈乳白色斑塊,表面光滑、平
4、近年來，外泌體在腫瘤液體活檢中的作用得到廣泛關注。外泌體(exosomes)是一種含有蛋白質、脂類、rna、代謝物、生長因子和細胞因子的小細胞外囊泡(extracellularvesicles，evs)，直徑為40-160nm，是細胞間的多功能轉運體[8]。生物分子通過質膜內陷被早期核內體吞噬，這些早期核內體被回收至質膜，或者被定位到溶酶體被降解，也可被分選形成晚期核內體，被稱為多泡體(multivesicular?bodies，mvbs)，mvbs與質膜融合時，mvbs中的腔內小泡通過胞外分泌進入細胞外環境，即外泌體分泌的過程[9]。所有細胞在正常和病理過程中都能分泌外泌體，并且在幾乎在所有類型的體液中均可有效檢測，比如唾液、血液、尿液、乳汁等。外泌體具有特殊的脂質雙分子結構，可以保護其內容物不被體液中的蛋白酶、肽酶以及核酸酶等降解[10]，使得外泌體及其內容物成為可被穩定檢測的腫瘤診斷標志物。
5、口腔白斑的癌變過程與包括microrna在內的分子的精確調節相關[11]。microrna是一組長度在18-25個核苷酸單鏈組成的非編碼rna,通過與靶基因核糖核酸(mrna)的3’-非編碼區(3’-utr)互補配對結合,在轉錄后水平修飾靶基因,從而調控基因表達。microrna通過調節其靶基因參與各種生物過程,包括生長、分化、凋亡和增殖[12]。研究發現mir-10b、mir-708在伴有上皮異常增生的口腔白斑組織中表達顯著升高,而mir-99b、mir-145、mir-181c的表達顯著下調[13]。組織中microrna的表達水平與細胞病理學特征相關，mir-21、mir-345和mir-181b在口腔癌中的表達顯著高于口腔白斑和正常黏膜組織。而在有絲分裂象增多、核質比高、染色深的口腔黏膜白斑細胞中，mir-21、mir-181b的表達增高。在細胞核增多或體積增大，核質比高的口腔白斑中mir-345高表達。microrna的表達還與組織病理學進展相關，在對進行性和非進行性發展口腔白斑的研究中發現，mir-21、mir-345和mir-181b的表達水平隨著疾病的發展持續升高[13-15]。綜合來看，口腔癌的發生發展過程中出現明顯異常表達的microrna，且表達趨勢不同、作用各不相同[16-22]。
6、mir-185是作為一種microrna，已被證實在不同類型的惡性腫瘤中發揮抑制作用，如非小細胞肺癌，胃癌，結直腸癌，肝細胞癌，骨肉瘤等[23-27]。我們發現不僅攜帶mir-185的外泌體可以有效治療口腔白斑，阻止白斑向口腔癌的轉化，從而有效預防口腔癌的發生，而且唾液和血漿來源的外泌體mir-185還可以作為判斷白斑癌變和口腔癌的早期診斷標志物。
7、對外泌體中的mir-185進行準確定量是唾液和血漿外泌體mir-185作為診斷標志物走向臨床應用過程中至關重要的一步。最常見的microrna定量方式是實時熒光定量pcr，主要分為相對定量和絕對定量。
8、相對定量是指將一個已處理樣本中的目的基因表達與另一個未處理樣本中相同基因的表達相比較，結果以處理樣本的表達量相對于未處理樣本表達量的倍數變化(增加或減少)，該方法需要內參基因的參與，內參基因的作用是對目標基因的表達進行歸一化，使目標基因在不同樣本之間具有可比性。但能目前夠用于外泌體microrna定量分析的理想內參基因依舊存在爭議。在口腔疾病領域，有學者在研究口腔扁平苔蘚患者的唾液外泌體microrna時將mir-16作為內參基因[28]，研究舍格倫綜合征患者選擇的是snrnau48[29]。在各類疾病的循環外泌體microrna相關研究中，不少學者選擇snrnau6作為內參基因[30]。然而一項對乙型肝炎或肝細胞癌患者與健康個體的血清外泌體樣本的研究認為mir-221、mir-103、let-7a、mir-181c、mir-181a和mir-26a是最穩定的內參基因，mir-16、mir-22和u6并不可靠[31]。最近有研究發現hsa-mir-6835-3p(特別是hsa-mir-6835-3p/hsa-mir-4468-3p組合)用于分析各類腫瘤(包括胰腺癌、結直腸癌、肝癌等)患者循環外泌體microrna是最佳的[32]。
9、絕對定量是指在實時熒光定量pcr實驗中，對已知量的樣本進行連續稀釋后擴增，生成標準曲線，適用于需要測定靶基因際拷貝數的研究，例如本專利技術涉及的用于診斷口腔白斑癌變和口腔癌的microrna分子標志物。因此本專利技術發現一種外泌體mir-185的絕對定量方法，用于口腔白斑癌變和口腔癌的早期診斷，從而提高口腔癌的早期診斷率，有利于改善患者預后。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于通過我們建立的絕對定量方法對外泌體mir-185進行快速、準確的定量，從而實現對口腔白斑和口腔癌患者的早期診斷。
2、因此，本專利技術涉及：
3、1.一種外泌體mir-185的絕對定量方法，主要用于口腔白斑癌變和口腔癌的早期診斷。
4、2.項1的方法，其中所述白斑為白斑單純增生本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種外泌體miR-185的絕對定量方法，該方法主要用于口腔白斑癌變和口腔癌的早期診斷。
2.權利要求1的方法，其中所述白斑為白斑單純增生、白斑伴上皮輕度異常增生、白斑伴上皮中度異常增生、白斑伴上皮重度異常增生。
3.權利要求1或2的方法，其中所述口腔癌為口腔鱗狀細胞癌。
4.權利要求1-3的方法，其中所述外泌體來源于口腔白斑和口腔癌患者的唾液或血漿。
5.權利要求1-4的方法主要涉及以下流程：唾液和血漿外泌體RNA的提取、引物設計與合成、miR-185標準物質的合成、標準曲線的建立、內參的選擇、miRNA的逆轉錄與PCR反應、數據統計分析。
【技術特征摘要】
1.一種外泌體mir-185的絕對定量方法，該方法主要用于口腔白斑癌變和口腔癌的早期診斷。
2.權利要求1的方法，其中所述白斑為白斑單純增生、白斑伴上皮輕度異常增生、白斑伴上皮中度異常增生、白斑伴上皮重度異常增生。
3.權利要求1或2的方法，其中所述口腔癌為口腔鱗狀細胞癌。<...
【專利技術屬性】
技術研發人員：關曉兵，夏倩，劉美彤，
申請(專利權)人：首都醫科大學附屬北京口腔醫院，
類型：發明
國別省市：
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