【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物分析，具體涉及一種基于splint-pcr法檢測(cè)c57bl/6j小鼠血清中反義寡核苷酸ps?dna的方法。
技術(shù)介紹
1、splintr-pcr法是一種利用pbcv?dna?ligase(也稱為splintr連接酶、pbcv-1?dnaligase或splintr?ligase)的dna連接技術(shù)，可以用于dna、rna的定性、定量檢測(cè)。相比于雜交elisa法，其具有靈敏度更高，檢測(cè)范圍更廣的優(yōu)勢(shì)。
2、splintr-pcr的檢測(cè)原理分為3步：
3、1、待檢測(cè)底物(例如dna、rna)、探針probe?a與探針probe?b的雜交：probe?a、probe?b分別與底物有一段序列堿基互補(bǔ)，且probe?a與probe?b序列相鄰，在構(gòu)建的雜交反應(yīng)體系中，先高溫變性，再緩慢退火，使得底物、probe?a、probe?b能雜交形成三體復(fù)合物。
4、2、splintr?ligase介導(dǎo)的連接反應(yīng)：為了連接probe?a與probe?b相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，構(gòu)建splintr連接反應(yīng)體系。加入一定活性單位的splintr?ligase，在最適連接溫度下進(jìn)行連接反應(yīng)。之后加熱失活。
5、3、qpcr反應(yīng)：在qpcr反應(yīng)體系中加入正向引物primer-f、反向引物primer-r、包含dna聚合酶的預(yù)混液、上一步得到的連接產(chǎn)物，以及雙淬滅探針(double-quenched?probe，用于進(jìn)一步降低反應(yīng)的背景值)。經(jīng)歷過多個(gè)循環(huán)的變性、退火、延伸步驟后，可用來檢測(cè)樣
6、反義寡核苷酸(antisense?oligonucleotides,asos)是短鏈的dna或rna分子，通過與目標(biāo)mrna互補(bǔ)結(jié)合，抑制其翻譯或穩(wěn)定性，從而調(diào)控基因表達(dá)。常用于基因功能研究和治療某些遺傳性疾病。splintr-pcr法已被用于實(shí)現(xiàn)asos的定量檢測(cè)，例如，文獻(xiàn)“shin?m,meda?krishnamurthy?p,devi?g,watts?jk.quantification?of?antisenseoligonucleotides?by?splint?ligation?and?quantitative?polymerase?chainreaction.nucleic?acid?ther.2022feb；32(1):66-73.doi:10.1089/nat.2021.0040.epub2021?dec?17.pmid:34928745；pmcid:pmc8817697.”中公開了splintr-pcr法可以有效檢測(cè)和定量生物樣品中的asos。該文獻(xiàn)中，對(duì)asos進(jìn)行定量的范圍為1pm-1um。在此現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，為了達(dá)到更高的應(yīng)用需求，人們?nèi)匀幌Ｍ軌驅(qū)⑼卣箂plintr-pcr法用于asos檢測(cè)的下限，從而提高檢測(cè)的靈敏度。
7、然而，splintr-pcr法本已是一種具有高靈敏度特點(diǎn)的檢測(cè)方法，其對(duì)較多樣品的檢測(cè)限可以達(dá)到亞納摩爾級(jí)(即皮摩爾級(jí))。在此極低檢測(cè)限的基礎(chǔ)上，要進(jìn)一步提升該方法對(duì)于特定樣品的檢測(cè)限，這需要針對(duì)特定的樣品對(duì)檢測(cè)中的各項(xiàng)條件進(jìn)行大量的優(yōu)化，具有很高的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問題，本專利技術(shù)提供基于splint-pcr法檢測(cè)c57bl/6j小鼠血清中反義寡核苷酸psdna的方法。
2、一種基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸psdna的方法，包括如下步驟：
3、步驟1，雜交：向待檢測(cè)樣本中加入探針probe?a溶液和探針probe?b溶液，進(jìn)行雜交，形成三體復(fù)合物；
4、步驟2，連接：向體系中加入splintr?ligase，進(jìn)行連接反應(yīng)；
5、步驟3，qpcr反應(yīng)：將步驟2得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行qpcr反應(yīng)，檢測(cè)；
6、其中，步驟1中，所述探針probe?a溶液、探針probe?b溶液和待檢測(cè)樣本的體積比為(1-3):(1-3):(2-10)；所述探針probe?a溶液的濃度為300-600nm，所述探針probe?b溶液的濃度為300-600nm；
7、步驟2中，所述splintr?ligase的添加量為0.5-1.25units/μl。
8、優(yōu)選的，所述待檢測(cè)樣本是c57bl/6j小鼠血清；
9、所述反義寡核苷酸psdna的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
10、探針probe?a的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；
11、探針probe?b的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
12、優(yōu)選的，步驟1中，所述探針probe?a、探針probe?b和待檢測(cè)樣本的體積比為2:2:10；所述探針probe?a溶液的濃度為500nm，所述探針probe?b溶液的濃度為500nm。
13、優(yōu)選的，步驟1中，雜交的條件為：90-95℃孵育5-40min；或，90-95℃孵育5-40min，51℃孵育30-40min。
14、優(yōu)選的，步驟1中，雜交的條件為：95℃孵育5min，51℃孵育30min。
15、優(yōu)選的，步驟2中，所述splintr?ligase的添加量為1.25units/μl。
16、優(yōu)選的，步驟2中，連接反應(yīng)的條件為：25-37℃孵育0.5-4h。
17、優(yōu)選的，步驟2中，連接反應(yīng)的條件為：25℃孵育4h。
18、優(yōu)選的，步驟3中，所述qpcr反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：
19、所述連接產(chǎn)物2-4.0μl、
20、dna聚合酶的預(yù)混液12.5μl、
21、正向引物溶液1-1.5μl、
22、反向引物溶液1-1.5μl、
23、雙淬滅探針溶液0.7-1.0μl、
24、水7.8-4.5μl
25、其中，所述正向引物溶液的濃度為8-12μm，所述反向引物溶液的濃度為8-12μm，所述雙淬滅探針溶液的濃度為8-12μm。
26、優(yōu)選的，所述dna聚合酶的預(yù)混液選自taqmantmfast?advanced?master?mix或itaquniversal?probes?supermix；
27、和/或，所述正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；
28、和/或，所述反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；
29、和/或，所述雙淬滅探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。
30、本專利技術(shù)將splint-pcr法應(yīng)用于檢測(cè)c57bl/6j小鼠血清中反義寡核苷酸psdna，為了達(dá)到更高的靈敏度，使定量檢測(cè)限降低到飛摩爾級(jí)的水平，本專利技術(shù)對(duì)檢測(cè)方法的各項(xiàng)條件(例如：探針的用量、splintr?ligase的用量、雜交條件、連接條件、dna聚合酶的選擇等)進(jìn)行了優(yōu)化，最終將檢測(cè)方法的定量范圍下限降低至250fm，相比于本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.按照權(quán)利要求1所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：所述待檢測(cè)樣本是C57BL/6J小鼠血清；
3.按照權(quán)利要求1所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟1中，所述探針Probe?A、探針Probe?B和待檢測(cè)樣本的體積比為2:2:10；所述探針Probe?A溶液的濃度為500nM，所述探針Probe?B溶液的濃度為500nM。
4.按照權(quán)利要求1所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟1中，雜交的條件為：90-95℃孵育5-40min；或，90-95℃孵育5-40min，51℃孵育30-40min。
5.按照權(quán)利要求4所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟1中，雜交的條件為：95℃孵育5min，51℃孵育30min。
6.按照權(quán)利要求1所述的基于
7.按照權(quán)利要求1所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟2中，連接反應(yīng)的條件為：25-37℃孵育0.5-4h。
8.按照權(quán)利要求7所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟2中，連接反應(yīng)的條件為：25℃孵育4h。
9.按照權(quán)利要求1所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：步驟3中，所述qPCR反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：
10.按照權(quán)利要求9所述的基于Splint-PCR法檢測(cè)反義寡核苷酸PS?DNA的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶的預(yù)混液選自TaqManTMFast?Advanced?Master?Mix或iTaq?UniversalProbes?Supermix；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸ps?dna的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.按照權(quán)利要求1所述的基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸ps?dna的方法，其特征在于：所述待檢測(cè)樣本是c57bl/6j小鼠血清；
3.按照權(quán)利要求1所述的基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸ps?dna的方法，其特征在于：步驟1中，所述探針probe?a、探針probe?b和待檢測(cè)樣本的體積比為2:2:10；所述探針probe?a溶液的濃度為500nm，所述探針probe?b溶液的濃度為500nm。
4.按照權(quán)利要求1所述的基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸ps?dna的方法，其特征在于：步驟1中，雜交的條件為：90-95℃孵育5-40min；或，90-95℃孵育5-40min，51℃孵育30-40min。
5.按照權(quán)利要求4所述的基于splint-pcr法檢測(cè)反義寡核苷酸ps?dna的方法，其特征在于：步驟1中，雜交的條件為：95℃孵育5min，51℃孵育30m...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賴力，扈正桃，薛愛琴，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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