【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種與紫花苜蓿氣孔密度緊密相關分子標記ms_chr4_73090327及其應用。
技術介紹
0、技術背景
1、紫花苜蓿(medicago?sativa?l.)是多年生飼草作物之一，含有豐富的粗蛋白和氨基酸，營養價值高，適口性好，環境適應能力強，是飼養牲畜的優良牧草。由于其出色的農藝特性和突出的經濟價值，尤其是高生物量產量和低生產成本，在我國種植面積十分廣泛，主要分布在我國北部和江淮流域，然而，中國北方地區的干旱氣候、水資源短缺，以及土壤鹽漬化和低溫等非生物脅迫因素，對紫花苜蓿的生長和發育構成了嚴重威脅，進而影響其產量和品質。因此，加強紫花苜蓿的抗逆育種研究對保障我國畜牧業的長期可持續發展至關重要。
2、氣孔位于大多數植物葉片的表面，是植物進行氣體交換和水分蒸騰的關鍵結構，直接影響植物的光合作用、呼吸作用和水分狀況。在干旱和高鹽等逆境條件下，氣孔的調節對維持植物水分平衡、減少水分蒸發具有至關重要。不同物種的研究表明，通過改變氣孔密度有望提高植物在干旱等逆境條件中的生存能力，從而提高紫花苜蓿的產量和質量。低氣孔密度的植物通過生理和發育適應，能在多變環境中保持生長。降低氣孔密度有助于植物在干旱條件下減少水分蒸騰，保持水分平衡，提高非脅迫環境下的水分利用效率。在高co2環境下，植物降低氣孔密度以減少水分損失，同時保持光合作用。面對重金屬脅迫，植物通過減少氣孔導度和胞間co2濃度，以降低重金屬吸收。氣孔密度的減少也影響了光合作用和呼吸作用，能在保證植物保證光合作用進行的同時，減少水分散失
3、全基因組關聯分析(genome-wide?association?study，gwas)可在全基因組范圍內同時檢測大規模群體內的遺傳變異，從而識別出與性狀相關的關鍵基因或位點。分子標記(molecular?marker)利用遺傳標記與目標性狀之間的關聯進行選擇，從而鑒定具有目標性狀的個體或基因型。目前，大量分子標記已被成功開發并應用于作物的遺傳育種和遺傳多樣性分析。其中，indel(基因組中插入或缺失的片段)標記，根據目標位點兩側的序列設計特異引物，進行pcr擴增，展現出擴增片段長度的多態性。這些標記具有條帶清晰、穩定性強以及經濟便捷等特點，在越來越多的作物中得到應用。
4、因此，本研究結合全基因組關聯分析開發與氣孔密度相關的分子標記，是加快紫花苜蓿新材料選育進程的有效手段之一，有利于推動紫花苜蓿抗逆新品種的培育。
技術實現思路
1、本專利技術的目的之一在于提供了一種與紫花苜蓿氣孔密度相關的indel分子標記。
2、本專利技術的目的之二在于提供上述與紫花苜蓿氣孔密度相關的indel分子標記的應用。
3、為實現上述目的，本專利技術采取如下技術方案：
4、本專利技術公開的氣孔密度相關的indel分子標記，位于紫花苜蓿第4號染色體上，所述分子標記命名為ms_chr4_73090327。
5、擴增與紫花苜蓿氣孔密度相關的indel分子標記的引物對，所述分子標記ms_chr4_73090327對應的引物對序列為：
6、ms_chr4_73090327-f：cactgccagctttgctg(seq?id?no.1所示)；
7、ms_chr4_73090327-r：gcttcaaggactcacttaaatagtc(seq?id?no.2所示)。
8、本專利技術還公開了上述分子標記引物對在紫花苜蓿氣孔密度相關分子標記輔助育種中的應用。也就是說本專利技術的分子標記可用于今后的分子標記輔助育種中，通過提取苗期葉片的dna，檢測是否存在本專利技術的分子標記，進而來鑒定紫花苜蓿材料的氣孔密度，從而確定紫花苜蓿氣孔密度的高低。所述檢測可以使用pcr檢測的方法，具體可以使用上述的分子標記引物對，所述檢測還可以通過測序方法進行。
9、本專利技術還公開了上述分子標記在鑒定紫花苜蓿氣孔密度中的應用，尤其是在篩選和鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低中的應用。具體地，用于鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低的具體步驟如下：
10、(1)以供試種質的dna為pcr擴增的模板，以上述分子標記ms_chr4_73090327對應的引物對進行pcr擴增，pcr擴增的反應體系如表1：
11、表1?pcr擴增的反應體系
12、
13、94℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火24s，72℃延伸24s，40個循環；72℃延伸10min；4℃保存。
14、(2)pcr產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測：取2.5μl，根據條帶的結果判斷紫花苜蓿氣孔密度的高低。
15、利用引物對ms_chr4_73090327-f、ms_chr4_73090327-r進行pcr擴增，如果pcr擴增產物僅有一條如seq?id?no.4所示的長度為250bp的特征條帶，則紫花苜蓿為低氣孔密度類型；或者既有一條如seq?id?no.4所示的長度為250bp的特征條帶，又有一條如seq?idno.5所示的長度為219bp的特征條帶，則紫花苜蓿為高氣孔密度類型。
16、另外，本專利技術還保護一種用于鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低的試劑盒，所述試劑盒中包含引物對ms_chr4_73090327-f、ms_chr4_73090327-r。所述試劑盒的其它成分均屬于常規的試劑。具體還包括10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶。本專利技術對所述引物對的濃度沒有特殊限制，采用本領域所熟知的引物濃度即可。本專利技術對所述10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶的來源沒有特殊限制，采用本領域所熟知的普通pcr擴增用試劑即可。
17、采用本專利技術的試劑盒可以快速的鑒定紫花苜蓿氣孔密度的高低，還可以快速的鑒定紫花苜蓿的氣孔密度基因型。具體方法參照鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低的具體步驟，通過對pcr擴增產物進行電泳檢測和/或測序，如果pcr擴增產物僅有一條如seq?id?no.4所示的長度為250bp的特征條帶，則紫花苜蓿為純合低氣孔密度基因型；如果pcr擴增產物既有一條如seq?id?no.4所示的長度為250bp的特征條帶，又有一條如seq?id?no.5所示的長度為219bp的特征條帶，則紫花苜蓿為雜合高氣孔密度基因型
18、本專利技術具有如下優點：
19、(1)本專利技術的專利技術人篩選出了一個與紫花苜蓿氣孔密度相關的分子標記ms_chr4_73090327，該分子標記位于4號染色體上，采用本專利技術的分子標記ms_chr4_73090327可以快速鑒定紫花苜蓿的氣孔密度的高低。
20、(2)利用與氣孔密度連鎖的標記進行篩選，有利于分子標記輔助選擇育種，其方法簡單可行，有利于提高效率，節省成本。
21、(3)本專利技術的分子標記具有檢測方便、擴增產物穩定、特異性高的特點，可以簡便、快速、高通量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.與紫花苜蓿氣孔密度相關的分子標記Ms_Chr473090327，其特征在于，所述分子標記Ms_Chr473090327是在紫花苜蓿第4號染色體上第73090327位點上插入/缺失片段TTTTCTTTCTTTGTTAGTAGAGTGTTTGGGA，所述分子標記Ms_Chr473090327對應的引物對序列為：
2.根據權利要求1所述的與紫花苜蓿氣孔密度相關的分子標記Ms?Chr473090327，其特征在于，所述分子標記Ms?Chr473090327為InDel標記。
3.權利要求1所述的分子標記Ms_Chr473090327在鑒定或輔助鑒定紫花苜蓿氣孔密度的高低中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低的方法，包括如下步驟：
5.一種鑒定紫花苜蓿氣孔密度高低的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1中所述的引物對。
6.權利要求5所述的試劑盒在鑒定紫花苜蓿氣孔密度基因型方面的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，利用試劑盒對紫花苜蓿氣孔密度基因型進行鑒定的方法為：
...【技術特征摘要】
1.與紫花苜蓿氣孔密度相關的分子標記ms_chr473090327，其特征在于，所述分子標記ms_chr473090327是在紫花苜蓿第4號染色體上第73090327位點上插入/缺失片段ttttctttctttgttagtagagtgtttggga，所述分子標記ms_chr473090327對應的引物對序列為：
2.根據權利要求1所述的與紫花苜蓿氣孔密度相關的分子標記ms?chr473090327，其特征在于，所述分子標記ms?chr473090327為indel標記。
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉文獻，陳嘉慧，熊聰慧，安斐斐，曹馨丹，馮雅琪，隋超，
申請(專利權)人：蘭州大學，
類型：發明
國別省市：
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