【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種表達抗禽流感病毒重組單克隆抗體的細胞及其篩選方法。
技術(shù)介紹
1、禽流感病毒(avian?influenzavirus,aiv)屬于正黏病毒科，其主要特點是宿主范圍廣，禽流感病毒宿主廣泛，雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉雞、鷓鴣、鴕鳥、孔雀等多種禽類易感，多種野鳥也可感染發(fā)病甚至死亡；偶爾還能感染海豹、鯨、貂、虎、狐貍、貓等哺乳動物和人。根據(jù)病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,ha)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,na)的抗原特征，可進一步將其分成16個h亞型(h1～h16)和9個n亞型(n1～n9)；另有從蝙蝠中新確認的亞型(h17和h18)。aiv根據(jù)病毒致病性不同，分為高致病性禽流感病毒(highlypathogenic?avian?influenza?virus，hpaiv)和低致病性禽流感病毒(low?pathogenicavian?influenzavirus，lpaiv)。至今，導致雞、火雞和其他經(jīng)濟禽類發(fā)生急性臨床癥狀的hpaiv都是h5或h7亞型，但不是所有的h5或h7亞型都是高致病性的，有的h5和h7亞型流感病毒致病性不高，這類病毒具有通過變異成為高致病性病毒的風險。世界動物衛(wèi)生組織(woah)將高致病性禽流感(highly?pathogenic?avian?influenza，hpai)，以及l(fā)paiv在家禽中毒力突然增加或可自然傳播給人類并造成嚴重后果的低致病性禽流感病毒引起的低致病性禽流感(low?pathogenic?avian?influen
2、高致病性的h7亞型禽流感病毒能導致感染禽類發(fā)生嚴重的臨床病變，死亡率高，對家禽業(yè)造成毀滅性影響。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(oie-wahis)報告的數(shù)據(jù)，2005年1月至2022年11月期間，各種h7亞型高致病性禽流感病毒在世界范圍內(nèi)引起了106次疫情暴發(fā)，發(fā)生在亞洲、歐洲、北美和大洋洲的10個國家，包括澳大利亞、加拿大、墨西哥、美國、朝鮮、中國、英國、西班牙、意大利和德國，造成3300多萬只家禽死亡。h7亞型禽流感病毒除了在家禽中爆發(fā)，給家禽業(yè)造成巨大損失外，還能跨越宿主界限，感染哺乳動物，特別是感染人類，給人造成嚴重的呼吸道疾病，甚至導致死亡。
3、h7亞型禽流感囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(ha)是流感病毒的主要免疫原性抗原。ha蛋白作為流感病毒的主要表面抗原，表面含有受體識別位點和抗原決定簇，是病毒與受體識別并結(jié)合的關(guān)鍵部位，還可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是亞型測定和抗原變異研究的重要靶蛋白。檢測過程中，常利用單克隆抗體高特異、高靈敏的特性，建立測流免疫層析、免疫熒光、血凝抑制(hemagglutination?inhibition，hi)、酶聯(lián)免疫吸附實驗等方法，對aiv抗原或抗體樣品進行臨床檢測診斷，單抗在診斷試劑的開發(fā)中具有非常重要的意義。特異性單抗還可以應(yīng)用于病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、抗原變異機制等基礎(chǔ)研究中，具有重要意義。但是，采用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)制備的單抗，需要依賴從小鼠腹水中純化，抗體產(chǎn)率普遍較低，且批次間的產(chǎn)率和質(zhì)量存在差異。因此，通過分子克隆技術(shù)將雜交瘤單抗轉(zhuǎn)化為重組抗體具有許多優(yōu)勢。一旦獲得抗體序列，就可以在重組表達系統(tǒng)中生產(chǎn)，而不需要宿主動物，避免使用實驗動物，符合動物福利的相關(guān)規(guī)定。生產(chǎn)的單克隆抗體具有高批量一致性和可重復(fù)性，可以避免雜交瘤細胞系遺傳漂變導致抗體產(chǎn)生的微小變化。重組抗體的另一個優(yōu)點是增加試劑多功能性的潛力。有了初級氨基酸序列，研究人員可以將基因融合到其他分子中，例如熒光團，以生成具有多種功能的定制工具。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)先利用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)獲得抗h7n9亞禽流感病毒ha蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞，在此基礎(chǔ)上，篩選出分泌抗體較好的一株雜交瘤細胞進行測序，獲得完整的輕鏈和重鏈序列，并將其克隆到pcho-1.0表達載體上。將hc和lc表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cho-s細胞。通過添加不同濃度的甲氨蝶呤和嘌呤霉素兩相選擇獲得穩(wěn)定表達的細胞系，據(jù)此完成了本專利技術(shù)。
2、第一方面，本專利技術(shù)提供一株可以穩(wěn)定表達抗病毒蛋白的重組單克隆抗體的細胞，所述細胞是通過雜交瘤細胞中測出抗病毒的單克隆抗體的重鏈和輕鏈基因序列，并將其克隆到表達載體中，轉(zhuǎn)染到cho-s細胞后獲得的穩(wěn)定表達抗病毒蛋白重組單克隆抗體(重組單抗)的細胞，所述細胞的名稱為：cho-s?r1h9-1c3，保藏號為：cgmcc?no.45828。
3、第二方面，本專利技術(shù)提供一種篩選穩(wěn)定表達抗禽流感病毒蛋白重組單抗的細胞的方法，所述篩選方法包括如下步驟：
4、s1.通過禽流感病毒純化蛋白免疫小鼠后，取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細胞融合，利用elisa試驗方法篩選陽性雜交瘤細胞；
5、s2.用s1所得雜交瘤細胞制備抗體，利用hi試驗方法篩選效價最高的單抗；
6、s3.對s2所得單抗測序，用5'race，3'race方法擴增獲得重鏈與輕鏈全長完整的片段，測序，得到全部序列；
7、s4.對s3測得的抗體重鏈和輕鏈的堿基序列進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化合成后的片段克隆到表達載體上，轉(zhuǎn)染細胞，根據(jù)添加不同濃度的甲氨蝶呤和嘌呤霉素兩相選擇獲得表達重組單抗的細胞系。
8、s5.將表達重組單抗的細胞系繼續(xù)傳代，對傳代后細胞上清中抗體的表達水平進行檢測，從而篩選出穩(wěn)定表達的細胞系。
9、進一步，在步驟s1中，所述禽流感為h7亞型禽流感病毒。
10、更進一步，所述h7亞型禽流感病毒包括根據(jù)ha基因序列進行分型的各種h7亞型禽流感病毒。
11、進一步，在步驟s1中，所述免疫小鼠的純化蛋白是h7亞型禽流感病毒ha蛋白。
12、優(yōu)選的，所述免疫小鼠的純化蛋白是h7n9亞型ck/sd008株純化的ha蛋白。
13、進一步，在步驟s3中，所述單抗重鏈可變區(qū)種系為ighv3，包括三個互補決定區(qū)(cdr1,cdr2,cdr3)，其氨基酸序列如seq?id?no：1、seq?id?no：2、seq?id?no：3所示；所述單抗輕鏈可變區(qū)種系為igkv15，包括三個互補決定區(qū)(cdr1,cdr2,cdr3)其氨基酸序列如seqid?no：4、seq?id?no：5、seq?id?no：6所示。
14、進一步，在步驟s4中，所述表達載體是真核表達載體，所述轉(zhuǎn)染細胞是真核細胞。
15、優(yōu)選的，所述真核表達載體是pcho-1.0，所述真核細胞是中國倉鼠卵巢細胞cho-s。
16、進一步，在步驟s5中，所述對抗體的表達水平進行檢測的方法包括elisa和hi。
17、本專利技術(shù)中的穩(wěn)定表達的細胞cho-s?r1h9-1c3，已向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)提供了生物保藏，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏物名稱：中國倉鼠卵巢細胞穩(wěn)定表達細胞系(mesocricetusaurat本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種可以穩(wěn)定表達抗病毒蛋白的重組單克隆抗體的細胞，所述細胞是通過雜交瘤細胞中測出抗病毒的單克隆抗體的重鏈和輕鏈基因序列，并將其克隆到表達載體中，轉(zhuǎn)染到細胞后獲得的穩(wěn)定表達抗病毒重組單克隆抗體(重組單抗)的細胞，所述細胞的名稱為：CHO-Sr1H9-1C3，保藏號為：CGMCC?NO.45828。
2.一種可以篩選穩(wěn)定表達抗禽流感病毒蛋白重組單克隆抗體細胞的方法，所述篩選方法包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S1中，所述禽流感病毒包括包括根據(jù)HA基因序列進行分型的各種H7亞型禽流感病毒。
4.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S1中，所述免疫小鼠的純化蛋白是H7N9亞型CK/SD008株純化的HA蛋白。
5.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S3中，所述抗體重鏈可變區(qū)種系為IGHV3，包括三個互補決定區(qū)(CDR1,CDR2,CDR3)，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示。
6.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S3中，所述抗體輕鏈可變區(qū)種系為IGKV15，包括三個互補決
7.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S4中，所述表達載體是真核表達載體；所述轉(zhuǎn)染細胞是真核細胞。
8.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S4中，所述真核表達載體是pCHO-1.0，所述真核細胞是中國倉鼠卵巢細胞CHO-S。
9.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S5中，所述對抗體的表達水平進行檢測的方法包括ELISA和HI。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種可以穩(wěn)定表達抗病毒蛋白的重組單克隆抗體的細胞，所述細胞是通過雜交瘤細胞中測出抗病毒的單克隆抗體的重鏈和輕鏈基因序列，并將其克隆到表達載體中，轉(zhuǎn)染到細胞后獲得的穩(wěn)定表達抗病毒重組單克隆抗體(重組單抗)的細胞，所述細胞的名稱為：cho-sr1h9-1c3，保藏號為：cgmcc?no.45828。
2.一種可以篩選穩(wěn)定表達抗禽流感病毒蛋白重組單克隆抗體細胞的方法，所述篩選方法包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟s1中，所述禽流感病毒包括包括根據(jù)ha基因序列進行分型的各種h7亞型禽流感病毒。
4.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟s1中，所述免疫小鼠的純化蛋白是h7n9亞型ck/sd008株純化的ha蛋白。
5.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟s3中，所述抗體重鏈可變區(qū)種系為...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王秀榮，陳化蘭，施建忠，姜永萍，李雁冰，孔暉暉，喬傳玲，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所中國動物衛(wèi)生與流行病學中心哈爾濱分中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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