【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及一種在細胞基因組精準插入dna的方法。
技術(shù)介紹
1、crispr/cas系統(tǒng)2013年首次在真核細胞中實現(xiàn)定點切割，隨后堿基編輯、引導編輯等多種類型的基因編輯工具被陸續(xù)開發(fā)，并在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應用價值。然而，目前在植物基因組精準插入外源dna還存在一些難題。目前主要有以下幾種策略實現(xiàn)dna插入，一、利用同源重組介導的細胞內(nèi)源修復途徑；二、利用非同源末端連接介導的修復途徑；三、利用轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性；四、利用逆轉(zhuǎn)錄酶活性介導的引導編輯系統(tǒng)；五、近年來還發(fā)展出引導編輯與序列特異性重組酶聯(lián)用的大片段插入方法。這些方法各有其優(yōu)缺點。
2、在植物中利用非同源末端連接修復途徑介導的大片段dna定點插入技術(shù)已有多項成功案例，創(chuàng)制了抗除草劑水稻、富含β-胡蘿卜素的營養(yǎng)加強型水稻等植物材料。這種方法利用cas9/sgrna復合體在基因組上定點產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后遞送進細胞的線性雙鏈dna插入雙鏈斷裂之間。細胞通過非同源末端連接的方式將供體dna和基因組之間的破損進行修復。但是，由這種方法產(chǎn)生的dna大片段插入并不精準。首先，外源遞送的供體片段dna兩端會受到細胞內(nèi)源的外切等過程的處理。第二，cas9/sgrna復合體產(chǎn)生的基因組dna雙鏈斷裂會產(chǎn)生不可預測的插入或刪除。第三，供體dna插入基因組的方向和拷貝數(shù)都是隨機的。因此，即使在雙鏈供體dna兩端加入化學修飾，也會有很大比例的不精準插入產(chǎn)生。
3、引導編輯是一種精準的編輯方式，核心組分包括cas9(h840a)、逆轉(zhuǎn)錄酶(mlv)以及pe
4、而其他在植物中實現(xiàn)dna插入的方法也各有優(yōu)缺點，如同源重組雖然精準但在植物細胞中效率太低；轉(zhuǎn)座酶在植物中報道較少；引導編輯與序列特異性重組酶聯(lián)用可以插入較長片段，但會在基因組上留下重組酶識別位點。因此，還需要開發(fā)更加高效精準的植物基因組dna定點插入技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種在細胞基因組精準插入dna的方法以及專用基因編輯器。
2、本專利技術(shù)利用引導編輯系統(tǒng)(pe)，使用逆轉(zhuǎn)錄模板上帶有插入序列部分片段的pegrna，在基因組上產(chǎn)生3’單鏈dna懸垂。同時，提供帶有3’單鏈懸垂的外源供體dna。供體dna的3’懸垂與基因組的3’懸垂進行堿基互補配對，從而實現(xiàn)精準的修復，以達到精準插入的目的。
3、第一方面，本專利技術(shù)要求保護一種用于基因編輯的核酸組件。
4、本專利技術(shù)要求保護的用于基因編輯的核酸組件，由pegrna和供體dna組成；
5、所述供體dna為一端是平齊末端，另一端存在3’端垂懸的雙鏈dna；
6、所述pegrna中的rtt序列與所述供體dna中的3’端垂懸部分的序列一致。
7、如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，所述pegrna包含間隔序列(spacer)、grna骨架序列、rtt序列(逆轉(zhuǎn)錄模板)和pbs序列(引物結(jié)合位點)，根據(jù)需要3’端還可包含結(jié)構(gòu)基序(tevopreq1)，其作用是以形成工程化的pegrna(epegrna)進一步增強pegrna?3’末端的穩(wěn)定性防止其被降解。
8、進一步地，在所述供體dna中，所述3’端垂懸部分的核苷酸長度為3-15nt；更進一步地，所述3’端垂懸部分的核苷酸長度為9-15nt(如12nt或9nt)。
9、在本專利技術(shù)的一些實施案例中，所述供體dna中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為gatgacgacgataag(未經(jīng)修飾的)；所述pegrna中的rtt序列為gaugacgacgauaag。相應地，所述pegrna的序列如seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.7、seq?idno.8、seq?id?no.9、seq?id?no.10或seq?id?no.11所示；和/或，所述供體dna由seq?id?no.12和seq?id?no.13所示兩條單鏈dna退火后形成。
10、在本專利技術(shù)的另一些實施案例中，所述供體dna中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為gtctgatccagagcc(未經(jīng)修飾的)；所述pegrna中的rtt序列為gucugauccagagcc。相應地，所述pegrna的序列如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3或seq?idno.5所示；和/或，所述供體dna由seq?id?no.14和seq?id?no.15所示兩條單鏈dna退火后形成。
11、進一步地，所述供體dna可為經(jīng)過修飾的供體dna。所述修飾可為如下任一：僅進行磷酸修飾；僅進行硫代修飾；既進行磷酸修飾又進行硫代修飾。
12、更進一步地，所述磷酸修飾為對組成所述供體dna的兩條鏈的5’末端均進行磷酸化修飾；和/或，所述硫代修飾為對組成所述供體dna的兩條鏈的兩端均進行兩個硫代修飾。
13、在本專利技術(shù)的一個實施案例中，所述供體dna為如下任一：(1)由seq?id?no.16和seqid?no.17所示兩條單鏈dna退火后形成；(2)由seq?id?no.18和seq?idno.19所示兩條單鏈dna退火后形成；(3)由seq?id?no.20和seq?id?no.21所示兩條單鏈dna退火后形成；(4)由seq?id?no.22和seq?id?no.23所示兩條單鏈dna退火后形成。
14、在上述本專利技術(shù)所要求保護的用于基因編輯的核酸組件的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預料到的變形形式也屬于本專利技術(shù)的保護范圍。如將所述供體dna設計成兩端都具有3’端懸垂的結(jié)構(gòu)，同時所述pegrna設計為一對(即兩個)，兩個pegrna中的rtt序列分別對應所述供體dna兩端的懸垂部分。
15、第二方面，本專利技術(shù)要求保護一種基因編輯器。
16、本專利技術(shù)所要求保護的基因編輯器包括前文第一方面中所述的核酸組件和如下蛋白組件：cas蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶。
17、進一步地，所述cas蛋白為具有完整核酸酶活性的cas蛋白，可為cas9蛋白，如spcas9蛋白。所述逆轉(zhuǎn)錄酶可為刪除rnase?h結(jié)構(gòu)域，并融合病毒核衣殼蛋白(nucleocapsid，nc)的m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。
18、第三方面，本專利技術(shù)要求保護一種用于基因編輯的成套產(chǎn)品。
19、本專利技術(shù)要求保護的用于基因編輯的成套產(chǎn)品，包括：
20、(a1)用于表達前文第一方面中所述pegrna的表達載體；
21、(a2)前文第一方面中所述供體dna。
22、進一步地，所述成套產(chǎn)品還可包括如下(本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種用于基因編輯的核酸組件，由pegRNA和供體DNA組成；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組件，其特征在于：在所述供體DNA中，所述3’端垂懸部分的核苷酸長度為3-15nt；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸組件，其特征在于：所述供體DNA中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為SEQ?ID?No.12的第22-36位，對應的所述pegRNA中的RTT序列為SEQ?ID?No.12的第22-36位；或，所述供體DNA中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為SEQ?ID?No.15的第22-36位，對應的所述pegRNA中的RTT序列為SEQ?ID?No.15的第22-36位；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的核酸組件，其特征在于：所述供體DNA經(jīng)過修飾；所述修飾為如下任一：僅進行磷酸修飾；僅進行硫代修飾；既進行磷酸修飾又進行硫代修飾；
5.一種基因編輯器，包括權(quán)利要求1-4中任一所述的核酸組件和如下蛋白組件：Cas蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶；
6.一種用于基因編輯的成套產(chǎn)品，包括：
7.權(quán)利要求1-4中任一所述的核酸組件或權(quán)利要求
8.一種對基因組進行基因編輯的方法，包括如下步驟：將權(quán)利要求1-4中任一所述的核酸組件或權(quán)利要求5所述基因編輯器或權(quán)利要求6所述成套產(chǎn)品導入受體，從而實現(xiàn)對所述受體的基因組進行基因編輯。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用或權(quán)利要求8所述方法，其特征在于：所述對基因組進行基因編輯為在基因組的特定位點插入目的DNA片段；
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應用或方法，其特征在于：所述受體選自如下任一：植物細胞、動物細胞、原生質(zhì)體、植物組織、動物組織、植物、動物或微生物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于基因編輯的核酸組件，由pegrna和供體dna組成；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸組件，其特征在于：在所述供體dna中，所述3’端垂懸部分的核苷酸長度為3-15nt；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸組件，其特征在于：所述供體dna中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為seq?id?no.12的第22-36位，對應的所述pegrna中的rtt序列為seq?id?no.12的第22-36位；或，所述供體dna中的3’端垂懸部分的核苷酸序列為seq?id?no.15的第22-36位，對應的所述pegrna中的rtt序列為seq?id?no.15的第22-36位；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的核酸組件，其特征在于：所述供體dna經(jīng)過修飾；所述修飾為如下任一：僅進行磷酸修飾；僅進行硫代修飾；既進行磷酸修飾又進行硫代修飾；
5...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高彩霞，雷源，陳璐，
申請(專利權(quán))人：中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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