【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程的，具體涉及一種靶向hmgb1基因的shrna靶點、shrna及其應用以及轉基因鼠模型的構建方法。
技術介紹
1、rna干擾(rna?interference，rnai)是一種非常有效的特異性抑制目的基因表達的技術，靶基因mrna的同源序列形成的雙鏈rnas(double?stranded?rnas,dsrnas)可以激活rnai途徑，短發卡rna轉錄采取穩定的頸環結構方案；克隆的寡聚核苷酸可較容易的表達shrna，這在哺乳動物細胞系激活rnai一種比較適宜和重現性較好的方法。
2、目前研究基因功能一種重要的方法是基因敲除，基因失活通過中斷目的基因的編碼序列實現，攜帶雜合子和純合子基因敲除的動物模型可以確定一個特定的基因功能，但是生成動物基因敲除模型需大量的人力、物力和財力；另一種抑制基因表達的方法是基因沉默，rnai的細胞過程已經被用來有效沉默基因的表達，rnai由引入的雙鏈rna激活，該雙鏈rna的序列與靶基因的序列具有同源性。內源性rna被消化成由21-23nt組成小干擾rnas(sirnas)，sirnas與核酸酶復合物形成一個rna誘導的沉默復合物(rna-inducedsilencing?complex，risc)，risc與目的內源性基因進行堿基配對，清除mrna。特異性基因沉默與傳統的基因敲除方法相比，在動物和細胞系模型可以快速方便地實現。
3、hmgb1基因在胚胎的發育過程中起到非常重要的作用，hmgb1基因的功能多樣性，決定該基因不可缺少，全身性敲除hmgb1的小
技術實現思路
1、針對上述問題，本專利技術的目的在于提供一種靶向hmgb1基因的shrna靶點、shrna及其應用以及轉基因鼠模型的構建方法。
2、本專利技術的
技術實現思路
如下：
3、本專利技術提供了一種靶向hmgb1基因的shrna靶點，所述靶向hmgb1基因的shrna靶點序列如seq?id?no.1-5所示，分別命名為shrna-hmgb1-1，shrna-hmgb1-2，shrna-hmgb1-3，shrna-hmgb1-4，shrna-hmgb1-5。
4、本專利技術還提供了一種靶向hmgb1基因的shrna，其為基于上述shrna靶點合成shrna，分別具有兩條互補的正義鏈、反義鏈序列；
5、所述正義鏈序列的結構為，5’端-xhoi限制性酶切位點+靶點序列正義鏈+發夾環+靶點序列反義鏈+終止子+mlui酶切位點+殘基-3’端；
6、所述反義鏈為5’端加入hindiii限制性酶切位點，之后形成與正義鏈序列反向互補的序列；
7、所述正義鏈序列與反義鏈序列反向互補；
8、所述發夾環的正義序列為ttcaagaga，反義序列為tctcttgaa；
9、所述終止子為6bp的胸腺嘧啶t組成；
10、基于shrna-hmgb1-1合成的正義鏈、反義鏈序列分別如seq?id?no.6和seq?idno.7所示；
11、基于shrna-hmgb1-2合成的正義鏈、反義鏈序列分別如seq?id?no.8和seq?idno.9所示；
12、基于shrna-hmgb1-3合成的正義鏈、反義鏈序列分別如seq?id?no.10和seq?idno.11所示；
13、基于pshrna-hmgb1-4合成的正義鏈、反義鏈序列分別如seq?id?no.12和seq?idno.13所示；
14、基于shrna-hmgb1-5合成的正義鏈、反義鏈序列分別如seq?id?no.14和seq?idno.15所示。
15、本專利技術還提供了一種靶向hmgb1基因的重組質粒，所述重組質粒為將上述shrna序列構建于質粒載體得到的重組質粒；
16、所述質粒載體包括psingle-tts-shrna載體；
17、所述重組質粒命名為psingle-tts-shrna-hmgb1-1，psingle-tts-shrna-hmgb1-2，psingle-tts-shrna-hmgb1-3，psingle-tts-shrna-hmgb1-4，psingle-tts-shrna-hmgb1-5。
18、本專利技術還提供了一種上述靶向hmgb1基因的重組質粒的構建方法，包括如下步驟：
19、1)合成上述靶向hmgb1基因的shrna；
20、2)將步驟1)的shrna寡核苷酸退火形成雙鏈dna片段；
21、3)表達載體進行雙酶切以及回收純化；
22、4)將雙鏈dna片段與步驟3)純化的載體連接得到重組質粒；
23、5)將重組質粒通過感受態細胞進行轉化、表達；
24、所述表達載體包括psingle-tts-shrna載體。
25、本專利技術還提供了上述靶向hmgb1基因的sirna或shrna或重組質粒在制備hmgb1基因表達抑制劑中的應用。
26、本專利技術還提供了上述靶向hmgb1基因的sirna或shrna或重組質粒在制備治療臟器纖維化藥物中的應用。
27、本專利技術還提供了一種hmgb1低表達轉基因鼠模型的構建方法，包括如下步驟：
28、1)擴增上述重組質粒；
29、所述擴增的引物序列如seq?id?no.16～21所示；
30、2)對重組質粒通過三酶切回收載體，提取目的基因shrna-hmgb1；
31、3)將目的基因通過注射方式轉入受體雌鼠，得到攜帶表達shrna-hmgb1的轉基因鼠模型；
32、對轉基因鼠的鑒定所采用的引物序列如seq?id?no.22～23所示。
33、本專利技術的有益效果如下：
34、本專利技術所述靶向hmgb1基因的shrna靶點、shrna以及重組質粒能夠特異性、高效地抑制hmgb1基因的表達，采用了knockout?single?vector?inducible?rnai?system，通過轉基因技術成功構建表達shrna-hmgb1的鼠模型，采用了tet-on系統，在飲水中加入強力霉素，使得小鼠在特定的時間特異的下調hmgb1的表達，能夠明顯下調hmgb1的表達，克服了hmgb1基因在新生鼠發育時期表達障礙，并且巧妙的避開了無hmgb1表達新生鼠不能存活的問題，所獲得的轉基因小鼠模型的全身器官具有shrna-hmgb1的表達，該轉基因小鼠模型可以用于研究hmgb1在多器官多疾病(如臟器的纖維化疾病)中的作用，利用該工具鼠可以得到多種器官疾病動物模型，為后續研究hmgb1的在免疫損傷中的功能提供了一個研究平臺。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種靶向HMGB1基因的shRNA靶點，其特征在于，所述shRNA靶點序列如SEQ?ID?NO.1-5所示。
2.一種靶向HMGB1基因的shRNA，其特征在于，其為基于權利要求1所述shRNA靶點合成shRNA，其分別具有兩條互補的正義鏈、反義鏈序列；
3.根據權利要求2所述的shRNA，其特征在于，所述反義鏈為5’端加入HindIII限制性酶切位點，之后形成與正義鏈序列反向互補的序列；
4.根據權利要求2所述的shRNA，其特征在于，所述發夾環的正義序列為TTCAAGAGA，反義序列為TCTCTTGAA。
5.根據權利要求2所述的shRNA，其特征在于，對應權利要求1所述shRNA靶點的shRNA的正義鏈、反義鏈序列分別如SEQ?ID?NO.6-SEQ?ID?NO.15所示。
6.一種靶向HMGB1基因的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒為將權利要求2所述shRNA序列構建于質粒載體得到的重組質粒；
7.一種權利要求6所述靶向HMGB1基因的重組質粒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.一種HMGB1低表達轉基因鼠模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種靶向hmgb1基因的shrna靶點，其特征在于，所述shrna靶點序列如seq?id?no.1-5所示。
2.一種靶向hmgb1基因的shrna，其特征在于，其為基于權利要求1所述shrna靶點合成shrna，其分別具有兩條互補的正義鏈、反義鏈序列；
3.根據權利要求2所述的shrna，其特征在于，所述反義鏈為5’端加入hindiii限制性酶切位點，之后形成與正義鏈序列反向互補的序列；
4.根據權利要求2所述的shrna，其特征在于，所述發夾環的正義序列為ttcaagaga，反義序列為tctcttgaa。
5.根據權利要求2所述的shrna，其特征...
【專利技術屬性】
技術研發人員：汪延生，劉明，馬冉，徐軍，
申請(專利權)人：廣州醫科大學附屬第一醫院廣州呼吸中心，
類型：發明
國別省市：
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