【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因編輯，具體涉及一種利用crispr/cas9系統敲除豬e4f1基因的方法。
技術介紹
1、e4f轉錄因子1（e4f1）是鋅指蛋白gli-kruppel家族的成員，現已被廣泛認為是一種轉錄因子。其dna結合活性通過腺病毒e1a的作用進行調節。通過蛋白水解切割，從全長蛋白質生成50-kda氨基末端產物。該蛋白質受e1a誘導的磷酸化的差異調節。在沒有e1a的情況下，全長基因產物抑制e4啟動子的轉錄，而50-kda形式在其存在時充當轉錄激活因子。可變剪接導致編碼不同蛋白質的多個轉錄本。e4f1在調節各種細胞過程中發揮著關鍵作用，包括細胞生長、增殖、分化、凋亡和壞死、dna損傷反應和細胞代謝。在生殖細胞的研究中，e4f1被發現在精原干細胞中通過調控線粒體功能和代謝維持其自我更新和穩態，這一發現揭示了e4f1在生殖細胞發育中的重要作用。
2、目前，e4f1基因的研究在豬等哺乳動物的研究比較少。通過利用crispr/cas9系統敲除豬e4f1基因，在體外和體內研究豬e4f1基因的功能，對于研究e4f1基因在豬發育過程中的功能及其發揮作用的機制具有重要意義。
3、crispr/cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源dna。而crispr/cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定dna修飾的技術，這項技術也是目前用于基因編輯的比較前沿的方法。以crispr/cas9為基礎的基因編輯技術在一系列疾病（例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病）的基因治療的應用領域
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術旨在提供一種利用crispr/cas9系統高效敲除豬e4f1基因的方法，為研究e4f1基因在豬發育過程中的功能及其作用機制提供基礎材料。
2、為了實現上述目的，本專利技術具體提供以下技術方案：
3、本專利技術第一方面提供了一種基于crispr/cas9技術的特異性靶向豬e4f1基因的sgrna組合物，包括第一sgrna和第二sgrna，其中第一sgrna靶向e4f1基因的第7750位至第7769位的序列，第二sgrna靶向e4f1基因的第8167位至第8186位的序列。
4、針對上述豬e4f1基因上的靶標序列，sgrna組合物中各sgrna序列優選如下：
5、第一sgrna：5’-cgcttatccggcaccaccga-3’（seq?id?no.3）；
6、第二sgrna：5’-gacgtcacccgtgattcacc-3’（seq?id?no.4）。
7、本專利技術試驗數據表明，如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的sgrna組合物（記作sg3,4）能夠實現優異的打靶效率和e4f1基因敲除效率，有利于快速高效的構建e4f1基因敲除細胞或動物。
8、本專利技術第二方面提供了一種特異性靶向豬e4f1基因的crispr/cas9基因敲除載體，具體的，該敲除載體中含有所述特異性靶向豬e4f1基因的sgrna。
9、在本專利技術的一些實施例中，還提供了所述crispr/cas9基因敲除載體具體為連接有所述特異性靶向豬e4f1基因的sgrna的px459載體。以px459載體為例，本專利技術還提供了crispr/cas9基因敲除載體的構建方法，具體可包括以下步驟：
10、（1）用bbsi酶切載體px459，得到線性化載體；
11、（2）在sgrna的兩端添加bbsi酶切位點，將帶bbsi酶切位點的sgrna序列的片段退火，形成含有bbsi酶切位點粘性末端的片段；
12、（3）將步驟（2）得到的退火產物與步驟（1）得到的線性化載體連接，構建連接有上述sgrna的px459載體。
13、優選地，在上述構建方法中，步驟（1）的酶切反應體系為：載體px459?1.5μl（1000ng），限制性內切酶bbsi?1μl，green?buffer?10×?1μl，ddh2o補齊至20μl；且酶切反應程序為：37℃，30min。
14、優選地，在上述構建方法中，步驟（2）的退火反應體系為：neb?buffer?2μl，上游序列1μl，下游序列1μl，ddh2o補齊至20μl；且退火反應程序為：95℃，5min；37℃，1h。
15、優選地，在上述構建方法中，步驟（3）的連接反應體系為：退火產物3μl，酶切產物2μl，t4dna?ligase?1μl，buf?t4?ligase?2μl，ddh2o補齊至20μl；且連接反應程序為：22℃，1h。
16、本專利技術第三方面提供了上述sgrna組合物和/或crispr/cas9基因敲除載體在高效敲除豬e4f1基因中的應用。
17、優選地，在上述應用中，將含有所述特異性靶向豬e4f1基因的兩組sgrna組合物的crispr/cas9基因敲除載體分別一同導入細胞，使e4f1基因雙位點編輯致片段缺失，進而得到陽性細胞。其中，將crispr/cas9基因敲除載體導入細胞可采用現有技術實現，包括但不限于電穿孔轉染等。
18、在上述應用中，陽性細胞可通過pcr等常規方法確定。優選地，具體可通過序列如seq?id?no.7-8所示的特異性引物進行檢測和確定。
19、優選地，在上述應用中，陽性細胞中豬e4f1基因表達水平的檢測方法包括以下步驟：
20、s1、提取待測細胞總rna，反轉錄成cdna；
21、s2、以步驟s2的cdna為模板，利用如seq?id?no.9-10所示的特異性引物通過熒光定量pcr（qpcr）擴增e4f1基因，檢測e4f1基因的表達水平。
22、在上述檢測方法中，qpcr可選擇以gapdh作為內參基因；更為優選地，gapdh所用引物序列如seq?id?no.11-12所示。
23、更為優選地，在上述步驟s2中，qpcr的反應體系為：2×universal?sybr?fastqpcr?mix?10μl，ddh2o?8.2μl，10μm上游引物0.4μl，10μm下游引物0.4μl，cdna模板1.0μl；且其反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性5s，60℃退火30s，40個循環；儀器自動設置熔解曲線。對qpcr實時監測得到的擴增曲線和熔解曲線進行分析，計算e4f1基因的表達量。
24、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
25、本專利技術首次利用crispr/cas9系統成功構建了豬e4f1基因敲除細胞，為體外和體內研究豬e4f1基因功能提供了重要材料。本專利技術通過分別對豬e4f1基因設計基因編輯雙靶位點，該靶位點均能被cas9核酸內切酶特異性識別，從而介導雙鏈斷裂，在自我修復系統的作用下通過本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種特異性靶向豬E4F1基因的sgRNA組合物，其特征在于，包括所述sgRNA組合物包括第一sgRNA和第二sgRNA；
2.?根據權利要求1所述的sgRNA組合物，其特征在于，所述第一sgRNA編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3，所述第二sgRNA編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
3.一種特異性靶向豬E4F1基因的CRISPR/Cas9基因敲除載體，其特征在于，其含有權利要求1或2所述的sgRNA。
4.根據權利要求3所述的CRISPR/Cas9基因敲除載體，其特征在于，具體為連接有所述sgRNA的PX459載體。
5.權利要求1或2所述的sgRNA組合物或權利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因敲除載體在敲除豬E4F1基因中的應用。
6.一種利用CRISPR/Cas9系統敲除豬E4F1基因的方法，其特征在于，將含有權利要求1所述sgRNA組合物的CRISPR/Cas9基因敲除載體導入細胞，使E4F1基因雙位點編輯致片段缺失，得到陽性細胞。
7.根據權利要求6所述的方法
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細胞為豬腎成纖維細胞。
9.?根據權利要求6所述的方法，其特征在于，利用序列如SEQ?ID?NO.7-8所示引物確定陽性細胞。
10.?根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在所述陽性細胞中，E4F1基因表達水平的檢測方法為：提取待測細胞總RNA，反轉錄成cDNA；以cDNA為模板，利用如SEQ?ID?NO.9-10所示引物進行熒光定量PCR。
...【技術特征摘要】
1.一種特異性靶向豬e4f1基因的sgrna組合物，其特征在于，包括所述sgrna組合物包括第一sgrna和第二sgrna；
2.?根據權利要求1所述的sgrna組合物，其特征在于，所述第一sgrna編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.3，所述第二sgrna編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
3.一種特異性靶向豬e4f1基因的crispr/cas9基因敲除載體，其特征在于，其含有權利要求1或2所述的sgrna。
4.根據權利要求3所述的crispr/cas9基因敲除載體，其特征在于，具體為連接有所述sgrna的px459載體。
5.權利要求1或2所述的sgrna組合物或權利要求3或4所述的crispr/cas9基因敲除載體在敲除豬e4f1基因中的應用。
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳礬，潘凱鑫，羅安鳳，顧浩，曾威，畢延震，任紅艷，周昌繁，劉松，
申請(專利權)人：湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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