【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學，具體地，涉及一種系統性紅斑狼瘡小鼠模型的構建方法及其應用。
技術介紹
1、系統性紅斑狼瘡(systemic?lupus?erythematosus，sle)是一種常見的以多系統的器官組織慢性炎癥性損害為特征的自身免疫性疾病，其病因和發病機制尚未完全闡明，目前認為可能由遺傳、炎癥、激素和環境等因素綜合作用，引起機體免疫穩態失衡、調節紊亂、抗原抗體復合物、補體復合物沉積血管引起免疫反應以及血栓形成最終導致局部或全身組織器官損害。系統性紅斑狼瘡會在人體的皮膚、腎臟、關節、血液、心臟、肺部等部位引發炎癥和疼痛等癥狀，甚至威脅患者生命。目前為止，系統性紅斑狼瘡還沒有明確的發病原因和任何已知的治愈方法。可見對系統性紅斑狼瘡的發病病因和發病機制的研究至關重要，而構建動物模型有助于疾病的研究，對探討發病機制和治療方法均具有重要意義。
2、目前國內外研究的系統性紅斑狼瘡小鼠模型主要分為兩種，即自發型小鼠模型、人工誘導型小鼠模型。自發型小鼠模型包括nzb、nzb/nzw?f1、mrl/lpr、mrl/n、bxsb小鼠等。人工誘導型小鼠模型是通過化學物質(如姥鮫烷、伴刀豆球蛋白a、細菌脂多糖等)誘導小鼠產生狼瘡樣癥狀。然而，雜交小鼠及誘導小鼠遺傳背景、環境背景復雜，在研究時存在各種不足。nzb/nzw小鼠模型表現狼瘡表型的原因不明，且發病周期長(6個月)，易受環境因素影響，且實驗過程不易控制，為研究疾病的發病機制帶來困難。mrl/lpr小鼠模型雖致病原因明確，由fas基因缺失導致，但mrl/lpr小鼠模型并不完全符
3、因此，為了更好地探討系統性紅斑狼瘡的發病機制以及靶向系統性紅斑狼瘡的藥物的開發，本領域亟需開發一種成模率高、造模時間短、操作簡單的系統性紅斑狼瘡小鼠模型構建方法。
技術實現思路
1、有鑒于此，為了克服現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種系統性紅斑狼瘡小鼠模型的構建方法及其應用。
2、本專利技術的上述專利技術目的通過以下技術方案得以實現：
3、本專利技術的第一方面提供了一種攜帶rasgrp1復合雜合突變p.t214i和p.k322x的系統性紅斑狼瘡小鼠模型的構建方法。其中，所述p.k322x中的x是指終止突變。
4、進一步，所述方法包括如下步驟：
5、(1)分別設計識別所述p.t214i位點、所述p.k322x位點的sgrna序列；
6、(2)分別配制sgrna/cas9注射液，分別注射所述sgrna/cas9注射液于小鼠受精卵中；
7、(3)將所得受精卵分別移植于假孕雌鼠中，獲得p.t214i位點雜合突變小鼠、p.k322x位點雜合突變小鼠；
8、(4)將所述p.t214i位點雜合突變小鼠進行雌雄交配，將p.k322x位點雜合突變小鼠進行雌雄交配，獲得p.t214i位點純合突變小鼠、p.k322x位點純合突變小鼠；
9、(5)將所述p.t214i位點純合突變小鼠與p.k322x位點純合突變小鼠雜交，獲得攜帶rasgrp1復合雜合突變p.t214i和p.k322x的系統性紅斑狼瘡小鼠模型。
10、進一步，識別所述p.t214i位點的sgrna序列如seq?id?no:1所示；
11、識別所述p.k322x位點的sgrna序列如seq?id?no:2所示。
12、進一步，所述sgrna/cas9注射液中所述sgrna和cas9?mrna的含量分別為(8.0-15.0)ng/μl、(10-40)ng/μl。
13、進一步，所述sgrna/cas9注射液中所述sgrna和cas9?mrna的含量分別為12.5ng/μl、25ng/μl。
14、進一步，所述p.t214i位點對應的基因突變位點為c.641c>t；
15、所述p.k322x位點對應的基因突變位點為c.964a>t，突變后形成終止密碼子。
16、在一些實施方案中，所述注射sgrna/cas9注射液的方式包括但不限于：顯微注射法、超聲波介導法、電穿孔法、聲穿孔法、光穿孔法、磁轉法、熱激法、磷酸鈣法、脂質體和聚合物法、納米粒子法或病毒轉化法。
17、在一些實施方案中，所述注射sgrna/cas9注射液的方式為顯微注射法。
18、在一些實施方案中，所述顯微注射法是利用管尖極細(0.1-0.5μm)的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發生的重組(rearrangement)、缺失(deletion)、復制(duplication)或易位(translocation)等現象而使外源基因嵌入到宿主的染色體內。
19、在本專利技術的具體實施方案中，所述sgrna/cas9注射液為sgrna/cas9顯微注射液，所述sgrna/cas9顯微注射液采用如下方法制備得到：利用無rna酶te-buffer混合sgrna及cas9(cas9?mrna：25ng/μl；sgrna：12.5ng/μl)。
20、在一些實施方案中，識別所述p.t214i位點的sgrna序列和識別所述p.k322x位點的sgrna序列并不局限于本專利技術具體實施方案中所采用的seq?id?no:1、seq?id?no:2，任何基于現有技術設計得到的能夠特異性識別所述p.t214i位點的sgrna和能夠特異性識別所述p.k322x位點的sgrna均在本專利技術的保護范圍內。
21、在一些實施方案中，所述設計sgrna的方法可以是通過在線數據庫(例如ncbi)得到靶基因(rasgrp1)的序列，利用在線sgrna設計平臺(https://design.synthego.com/#/)分析得到目的基因的靶點序列(20bp)的信息，從中選擇編輯效率評分高、脫靶評分低的靶點，進而以化學合成的方式獲得sgrna全長序列。
22、在本專利技術的具體實施方案中，識別所述p.t214i位點的sgrna序列如seq?id?no:1所示；識別所述p.k322x位點的sgrna序列如seq?id?no:2所示。
23、在本專利技術的具體實施方案中，所述小鼠受精卵采用如下方法獲取得到：胚胎供體雌鼠超排卵(腹腔注射pmsg?20iu/只，48h后腹腔注射hcg?30iu/只)，與雄鼠合籠后取受精卵，即得小鼠受精卵。
24、在本專利技術中，所述rasgrp1突變基因與野生型小鼠的rasgrp1基因相比，rasgrp1基因序列同時存在如下突變位點c.641c>t、c.964a>t。
25、本專利技術首次創造性地發現rasgrp1復合雜合突變(p.t214i，p.k322x)和小鼠本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種攜帶Rasgrp1復合雜合突變p.T214I和p.K322X的系統性紅斑狼瘡小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，識別所述p.T214I位點的sgRNA序列如SEQID?NO:1所示；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9注射液中所述sgRNA和Cas9?mRNA的含量分別為(8.0-15.0)ng/μL、(10-40)ng/μL。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA/Cas9注射液中所述sgRNA和Cas9?mRNA的含量分別為12.5ng/μL、25ng/μL。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述p.T214I位點對應的基因突變位點為c.641C>T；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法構建得到的系統性紅斑狼瘡小鼠模型在篩選用于治療和/或預防系統性紅斑狼瘡的藥物中的應用。
7.一種攜帶Rasgrp1復合雜合突變p.T214I和p.K322X的系統性紅斑狼瘡小鼠模型
8.一種用于Rasgrp1基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述系統包括Cas9mRNA、權利要求1中所述的sgRNA。
9.權利要求8所述的系統在構建攜帶Rasgrp1復合雜合突變p.T214I和p.K322X的系統性紅斑狼瘡小鼠模型中的應用。
10.Rasgrp1基因上的突變位點p.T214I和p.K322X在構建攜帶Rasgrp1復合雜合突變p.T214I和p.K322X的系統性紅斑狼瘡小鼠模型中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種攜帶rasgrp1復合雜合突變p.t214i和p.k322x的系統性紅斑狼瘡小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，識別所述p.t214i位點的sgrna序列如seqid?no:1所示；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgrna/cas9注射液中所述sgrna和cas9?mrna的含量分別為(8.0-15.0)ng/μl、(10-40)ng/μl。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgrna/cas9注射液中所述sgrna和cas9?mrna的含量分別為12.5ng/μl、25ng/μl。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述p.t214i位點對應的基因突變位點為c.641c>t；
6.根據權利...
【專利技術屬性】
技術研發人員：毛華偉，李玉璐，邢雯璐，鄧夢月，盧丹，楊夢陽，陳雄斌，
申請(專利權)人：首都醫科大學附屬北京兒童醫院，
類型：發明
國別省市：
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