【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細胞模型的構(gòu)建方法，尤其涉及用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、肺動脈高壓(pulmonary?hypertension,ph)是一種威脅生命的進展性疾病，以肺血管內(nèi)皮細胞功能障礙和血管重構(gòu)為特征，肺動脈壓力和肺血管阻力逐漸升高，最終發(fā)展為右心室肥厚、心力衰竭甚至死亡。隨著對ph病因及發(fā)病機制的深入認識，目前臨床治療ph的方法包括：氧療、血管舒張劑、靶向藥物和肺移植等，這些方法可一定程度上改善患者生存質(zhì)量，提高生存率，但并不能逆轉(zhuǎn)疾病進程，同時造成巨大的臨床和經(jīng)濟負擔(dān)，reveal注冊研究結(jié)果顯示：ph患者5年生存率僅為57％。因而有必要加深對肺動脈高壓機制的研究。
2、肺動脈高壓的發(fā)病機制十分復(fù)雜，迫切需要進一步探究肺動脈高壓的發(fā)病機制和治療策略。肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展與肺血管重構(gòu)密切相關(guān)，涉及環(huán)境因素(缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等)、遺傳因素(基因突變)和表觀遺傳因素(dn?a甲基化、組蛋白乙?；头蔷幋arna調(diào)控等)。其中，肺動脈內(nèi)皮細胞在維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細胞參與合成及分泌多種生長因子和血管活性物質(zhì)，如內(nèi)皮素、一氧化氮、五羥色胺、血栓烷和前列環(huán)素等，以上物質(zhì)可直接或間接影響肺動脈平滑肌細胞的生長和收縮。因而，進一步探究內(nèi)皮細胞在肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展中的作用機制可為臨床治療肺動脈高壓提供科學(xué)依據(jù)。
3、目前多應(yīng)用動物模型研究肺動脈高壓研究，主要包括單純慢性低氧、野百合堿(monocrotaline,mct)注射、慢性低氧聯(lián)合su5416、手術(shù)分
4、隨著細胞生物學(xué)的發(fā)展，新型技術(shù)和培養(yǎng)試劑的應(yīng)用促使人源原代細胞作為研究對象成為可能。相較于動物模型和細胞系，人源原代細胞保留了更多人體內(nèi)原始組織的生物學(xué)特征，可更好地建立細胞疾病模型。但獲取肺動脈高壓患者肺組織進行原代細胞培養(yǎng)十分困難，僅少數(shù)終末期肺動脈高壓患者行肺移植術(shù)時可獲取到肺血管原代內(nèi)皮細胞。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法。
2、用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
3、(1)采用histopaque-10771富集分離肺動脈高壓患者外周血中的cd34細胞集中存在的單個核細胞，然后用含有生長因子的egm-2mv培養(yǎng)基中培養(yǎng)重懸單個核細胞，再鋪入在包被了纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板中培養(yǎng)；
4、(2)鋪板2天后，吸走未貼壁細胞；對貼壁細胞進行清洗，重新加入所述含有生長因子的egm-2mv培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，定時換液和添加纖維粘連蛋白，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞定向分化，培養(yǎng)2周后開始出現(xiàn)內(nèi)皮細胞。
5、內(nèi)皮祖細胞(endothelial?progenitor?cell,epc)作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，在維持血管的動態(tài)修復(fù)及血管新生方面發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮祖細胞來源于骨髓，循環(huán)于外周血中，且具有良好增殖潛能，且內(nèi)皮祖細胞與肺動脈高壓的發(fā)病密切相關(guān)。因而可通過采集肺動脈高壓患者外周血，富集內(nèi)皮祖細胞，進行體外原代細胞培養(yǎng)，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞分化為內(nèi)皮細胞，構(gòu)建肺動脈高壓內(nèi)皮細胞模型。在本專利技術(shù)中，步驟(1)采用histopaque-10771試劑進行內(nèi)皮祖細胞富集，可高效獲得cd34細胞集中存在的單個核細胞。
6、在培養(yǎng)過程中，專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞更容易在早期貼壁，因此可以在細胞鋪板的2天后，吸走未貼壁的細胞，增加獲得的內(nèi)皮祖細胞的特異性，提高內(nèi)皮祖細胞純度。
7、本專利技術(shù)的含有生長因子的egm-2mv培養(yǎng)基含有以下組分：10％胎牛血清25ml、氫化可的松0.2ml、重組人堿性成纖維細胞生長因子2ml、血管生長因子0.5ml、再生人r3胰島素樣生長因子-1?0.5ml、抗壞血酸0.5ml、人表皮生長因子0.5ml、ga-1000?0.5ml。
8、步驟(1)中，histopaque-10771試劑與肺動脈高壓患者外周血混合后在室溫下離心400×g離心30分鐘，并確保離心機的制動和加速是在最低設(shè)置，避免劇烈的制動和加速影響層分離。
9、步驟(1)中，包被培養(yǎng)板的纖維粘連蛋白濃度為0.1mg/ml。纖維粘連蛋白作為胞外基質(zhì)盡可能模擬體內(nèi)環(huán)境，可促進內(nèi)皮祖細胞的黏附和定植。
10、步驟(1)中，培養(yǎng)板接種細胞密度為2×106/孔。
11、步驟(2)中，采用磷酸鹽緩沖液(pbs)或適當(dāng)量細胞培養(yǎng)基洗滌貼壁細胞。
12、步驟(2)中，培養(yǎng)期間，每3天進行一次細胞換液。
13、本專利技術(shù)還包括擴增培養(yǎng)步驟，即步驟(3)：內(nèi)皮祖細胞分化而來的內(nèi)皮細胞開始出現(xiàn)，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，使用含0.25％?edta的胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞密度，鋪在包被纖維粘連蛋白的細胞培養(yǎng)皿中，進行擴增培養(yǎng)。
14、本專利技術(shù)中的培養(yǎng)條件為5％?co2濃度、37℃。
15、與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本專利技術(shù)通過采集肺動脈高壓患者外周血，并富集內(nèi)皮祖細胞進行誘導(dǎo)分化，構(gòu)建可用于肺動脈高壓機制研究的原代內(nèi)皮細胞模型。其優(yōu)勢在于以下幾點：
16、1.相較于通過獲取人肺組織培養(yǎng)原代內(nèi)皮細胞，外周血獲取門檻更低、更便捷，只需少量外周血即可進行原代細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化；
17、2.相較于傳統(tǒng)動物模型，本專利技術(shù)采用的人體原代細胞能夠保留更多體內(nèi)原始組織的生物學(xué)特征，構(gòu)建的細胞模型能夠更真實地反應(yīng)肺動脈高壓血管重塑中的內(nèi)皮損傷狀態(tài)；
18、3.本專利技術(shù)通過內(nèi)皮祖細胞分化為內(nèi)皮細胞，結(jié)果表明通過肺動脈高壓患者內(nèi)皮祖細胞分化而來的內(nèi)皮細胞可以很好地表征該疾病中的內(nèi)皮細胞損傷狀態(tài)，因此構(gòu)建的肺動脈高壓內(nèi)皮細胞模型有助于研究肺動脈高壓細胞和分子機制，可用于篩選肺動脈高壓治療藥物，探尋潛在的肺動脈高壓治療靶點。
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1.用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述含有生長因子的EGM-2MV培養(yǎng)基含有以下組分：10％胎牛血清25mL、氫化可的松0.2mL、重組人堿性成纖維細胞生長因子2mL、血管生長因子0.5mL、再生人R3胰島素樣生長因子-1?0.5mL、抗壞血酸0.5mL、人表皮生長因子0.5mL、GA-1000?0.5mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，Histopaque-10771試劑與肺動脈高壓患者外周血混合后在室溫下離心400×g離心30分鐘，并確保離心機的制動和加速是在最低設(shè)置，避免劇烈的制動和加速影響層分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，包被培養(yǎng)板的纖維粘連蛋白濃度為0.1mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(2)中，采用磷酸鹽緩沖液或細胞培養(yǎng)基洗滌貼壁細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(2)中，培養(yǎng)期間，每3天進行一次細胞換液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述還包括擴增培養(yǎng)步驟，即步驟(3)：內(nèi)皮祖細胞分化而來的內(nèi)皮細胞開始出現(xiàn)，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，使用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞密度，鋪入包被纖維粘連蛋白的細胞培養(yǎng)皿中，進行擴增培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述本專利技術(shù)中的培養(yǎng)條件為5％CO2濃度、37℃。
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述含有生長因子的egm-2mv培養(yǎng)基含有以下組分：10％胎牛血清25ml、氫化可的松0.2ml、重組人堿性成纖維細胞生長因子2ml、血管生長因子0.5ml、再生人r3胰島素樣生長因子-1?0.5ml、抗壞血酸0.5ml、人表皮生長因子0.5ml、ga-1000?0.5ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，histopaque-10771試劑與肺動脈高壓患者外周血混合后在室溫下離心400×g離心30分鐘，并確保離心機的制動和加速是在最低設(shè)置，避免劇烈的制動和加速影響層分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺動脈高壓研究的內(nèi)皮祖細胞模型的構(gòu)建方法，其特征是，所述步驟(1)中，包被培養(yǎng)板的纖維粘連蛋白濃度為0.1mg/ml。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：沈毅，劉春麗，李娟，林小靖，何嘉豪，姚漪婷，王冠理，楊佳諾，莫展杰，任妮，陳舒敏，
申請(專利權(quán))人：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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