【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本公開(kāi)涉及分子生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種crispr檢測(cè)體系及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、從1928年人類(lèi)首次意識(shí)到dna是一種遺傳物質(zhì)開(kāi)始，針對(duì)核糖核酸和脫氧核糖核酸的研究從未停止過(guò)。在醫(yī)學(xué)和檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展的歷程當(dāng)中，人們也逐漸意識(shí)到dna和rna的檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的必備工具和關(guān)鍵步驟。通過(guò)對(duì)核酸的檢測(cè)和分析，研究人員能夠了解到許多遺傳型疾病的致病原理，可以用于區(qū)分癌癥的具體分型，還可以用于感染性疾病的診斷。
2、2012年，人們發(fā)現(xiàn)了crispr技術(shù)應(yīng)用于基因編輯的潛質(zhì)，crispr(clusteredregularly?interspaced?short?palindromic?repeats)是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列，是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭(zhēng)產(chǎn)生的免疫武器，簡(jiǎn)單說(shuō)就是病毒能把自己的基因整合到細(xì)菌，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌為了將病毒的外來(lái)入侵基因清除，進(jìn)化出crispr系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，細(xì)菌可以不動(dòng)聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)，是古菌和細(xì)菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。而后，crispr技術(shù)又被證實(shí)可以用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，并且發(fā)現(xiàn)了更多針對(duì)不同類(lèi)型核酸的特異性檢測(cè)工具。但是crispr-cas平臺(tái)應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域仍有許多不足之處：①crispr檢測(cè)體系需提前制備rnp復(fù)合體，在加入dna后反應(yīng)立刻進(jìn)行，過(guò)程不可控；②crispr分子檢測(cè)分為兩個(gè)階段，擴(kuò)增階段和檢測(cè)階段，擴(kuò)增階段存在相互影響難以集成在單個(gè)體系，影響該平臺(tái)應(yīng)用于
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、以下是對(duì)本文詳細(xì)描述的主題的概述。本概述并非是為了限制權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
2、本公開(kāi)實(shí)施例提供了一種crispr檢測(cè)體系，包括crispr/cas反應(yīng)體系和靶基因擴(kuò)增體系，其中，所述crispr檢測(cè)體系還包括保護(hù)核酸序列以及保護(hù)核酸序列的破壞組分。
3、在一些示例性實(shí)施方式中，所述crispr檢測(cè)體系包括識(shí)別靶序列的sgrna，所述保護(hù)核酸序列包括與所述sgrna至少部分互補(bǔ)的dna序列；所述保護(hù)核酸序列的破壞組分包括雙鏈特異性核酸酶。
4、在一些示例性實(shí)施方式中，所述dna序列與所述sgrna的序列至少30％互補(bǔ)。
5、在一些示例性實(shí)施方式中，所述dna序列與所述sgrna的序列至少30％互補(bǔ)、31％互補(bǔ)、32％互補(bǔ)、33％互補(bǔ)、34％互補(bǔ)、35％互補(bǔ)、36％互補(bǔ)、37％互補(bǔ)、38％互補(bǔ)、39％互補(bǔ)、40％互補(bǔ)、41％互補(bǔ)、42％互補(bǔ)、43％互補(bǔ)、44％互補(bǔ)、45％互補(bǔ)、46％互補(bǔ)、47％互補(bǔ)、48％互補(bǔ)、49％互補(bǔ)、50％互補(bǔ)、51％互補(bǔ)、52％互補(bǔ)、53％互補(bǔ)、54％互補(bǔ)、55％互補(bǔ)、56％互補(bǔ)、57％互補(bǔ)、58％互補(bǔ)、59％互補(bǔ)、60％互補(bǔ)、61％互補(bǔ)、62％互補(bǔ)、63％互補(bǔ)、64％互補(bǔ)、65％互補(bǔ)、66％互補(bǔ)、67％互補(bǔ)、68％互補(bǔ)、69％互補(bǔ)、70％互補(bǔ)、71％互補(bǔ)、72％互補(bǔ)、73％互補(bǔ)、74％互補(bǔ)、75％互補(bǔ)、76％互補(bǔ)、77％互補(bǔ)、78％互補(bǔ)、79％互補(bǔ)、80％互補(bǔ)、81％互補(bǔ)、82％互補(bǔ)、83％互補(bǔ)、84％互補(bǔ)、85％互補(bǔ)、86％互補(bǔ)、87％互補(bǔ)、88％互補(bǔ)、89％互補(bǔ)、90％互補(bǔ)、91％互補(bǔ)、92％互補(bǔ)、93％互補(bǔ)、94％互補(bǔ)、95％互補(bǔ)、96％互補(bǔ)、97％互補(bǔ)、98％互補(bǔ)、99％互補(bǔ)、100％互補(bǔ)。
6、在一些示例性實(shí)施方式中，所述crispr檢測(cè)體系還包括cas酶、用于擴(kuò)增靶序列的特異性引物、dna聚合酶、檢測(cè)探針及反應(yīng)混合液；其中，所述cas酶選自cas12a、cas12b、其同系物、或其修飾形式中的任意一種或多種。
7、在一些示例性實(shí)施方式中，所述cas酶是cas12a酶。
8、在一些示例性實(shí)施方式中，所述靶基因擴(kuò)增體系是恒溫?cái)U(kuò)增體系。
9、在一些示例性實(shí)施方式中，所述恒溫?cái)U(kuò)增體系是raa擴(kuò)增、rpa擴(kuò)增及l(fā)amp擴(kuò)增及其變形體系中的任意一種或多種。
10、在一些示例性實(shí)施方式中，所述檢測(cè)探針帶有fam標(biāo)記、hex標(biāo)記、vic標(biāo)記、rox標(biāo)記中的任意一種或多種。
11、在一些示例性實(shí)施方式中，所述raa擴(kuò)增、rpa擴(kuò)增及l(fā)amp擴(kuò)增的反應(yīng)溫度范圍在10℃-65℃之間。
12、在一些示例性實(shí)施方式中，rpa反應(yīng)溫度在16℃-45℃之間；優(yōu)選地37℃-42℃之間。
13、在一些示例性實(shí)施方式中，lamp反應(yīng)溫度在37℃-65℃之間；優(yōu)選地約65℃。
14、在一些示例性實(shí)施方式中，raa反應(yīng)溫度在30℃-42℃之間；優(yōu)選地37℃-39℃之間。
15、在一些示例性實(shí)施方式中，在所述raa擴(kuò)增、rpa擴(kuò)增及l(fā)amp擴(kuò)增進(jìn)行1-15分鐘，優(yōu)選地3-12分鐘，更優(yōu)選地5-10分鐘之后，添加所述雙鏈特異性核酸酶。
16、本公開(kāi)實(shí)施例還提供了一種crispr檢測(cè)試劑盒，所述crispr檢測(cè)試劑盒包括上述的crispr檢測(cè)體系的組分。
17、本公開(kāi)實(shí)施例還提供了一種crispr檢測(cè)可控化的方法，所述crispr檢測(cè)可控化的方法使用上述的crispr檢測(cè)體系的組分或上述的crispr檢測(cè)試劑盒，包括以下步驟：
18、混合所述crispr檢測(cè)體系的組分，所述crispr檢測(cè)體系的組分包括：cas12a酶、sgrna、與sgrna至少部分互補(bǔ)的dna序列、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的上下游引物、檢測(cè)探針、反應(yīng)混合液；
19、加入dna模板，擴(kuò)增靶基因，反應(yīng)溫度為16℃-65℃，反應(yīng)時(shí)間為5-10min；
20、在所述crispr檢測(cè)體系中添加雙鏈特異性核酸酶dsn及反應(yīng)混合液；
21、充分混合后，將反應(yīng)體系置于25℃-37℃，然后使用熒光定量pcr儀觀察熒光信號(hào)變化。
22、本公開(kāi)實(shí)施例還提供了crispr核酸檢測(cè)方法的應(yīng)用，其中將上述的crispr檢測(cè)體系的組分、上述的crispr檢測(cè)試劑盒或上述的crispr檢測(cè)可控化的方法應(yīng)用于單鏈dna或雙鏈dna的檢測(cè)，所述應(yīng)用為非診斷目的。
23、在一些示例性實(shí)施方式中，用于猴痘病毒的基因檢測(cè)，包括使用上述的crispr檢測(cè)體系的組分、上述的crispr檢測(cè)試劑盒或上述的crispr檢測(cè)可控化的方法，其中，
24、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的上游引物為seq?id?no.2，下游引物為seq?id?no.3；
25、sgrna為seq?id?no.4；
26、與sgrna互補(bǔ)的dna序列為seq?id?no.5；
27、檢測(cè)探針為fam-tttatt-bhq1。
28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)使cirspr檢測(cè)步驟變得可控化，同時(shí)使得crispr檢測(cè)體系和rpa/lamp等擴(kuò)增體系整合在一個(gè)體系當(dāng)中并提高了檢測(cè)效率。此方案可應(yīng)用于任何體外crispr反應(yīng)的步驟，從而控制cas酶的切割活性起始時(shí)間，方本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種CRISPR檢測(cè)體系，包括CRISPR/Cas反應(yīng)體系和靶基因擴(kuò)增體系，其中，所述CRISPR檢測(cè)體系還包括保護(hù)核酸序列以及保護(hù)核酸序列的破壞組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR檢測(cè)體系，其中，所述CRISPR檢測(cè)體系包括識(shí)別靶序列的sgRNA，所述保護(hù)核酸序列包括與所述sgRNA至少部分互補(bǔ)的DNA序列；所述保護(hù)核酸序列的破壞組分包括雙鏈特異性核酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的CRISPR檢測(cè)體系，其中，所述CRISPR檢測(cè)體系還包括Cas酶、用于擴(kuò)增靶序列的特異性引物、DNA聚合酶、檢測(cè)探針及反應(yīng)混合液；其中，所述Cas酶選自Cas12a、Cas12b、其同系物、或其修飾形式中的任意一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的CRISPR檢測(cè)體系，其中，所述Cas酶是Cas12a酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR檢測(cè)體系，其中，所述靶基因擴(kuò)增體系是恒溫?cái)U(kuò)增體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CRISPR檢測(cè)體系，其中，所述恒溫?cái)U(kuò)增體系是RAA擴(kuò)增、RPA擴(kuò)增、LAMP擴(kuò)增及其變形體系中的任意
7.一種CRISPR檢測(cè)試劑盒，所述CRISPR檢測(cè)試劑盒包括權(quán)利要求1至6中所述的CRISPR檢測(cè)體系的組分。
8.一種CRISPR檢測(cè)可控化的方法，所述CRISPR檢測(cè)可控化的方法使用權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的CRISPR檢測(cè)體系的組分或權(quán)利要求7所述的CRISPR檢測(cè)試劑盒，包括以下步驟：
9.一種CRISPR核酸檢測(cè)方法的應(yīng)用，其中將權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的CRISPR檢測(cè)體系的組分、權(quán)利要求7所述的CRISPR檢測(cè)試劑盒或權(quán)利要求8所述的CRISPR檢測(cè)可控化的方法應(yīng)用于單鏈DNA或雙鏈DNA的檢測(cè)，所述應(yīng)用為非診斷目的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，用于猴痘病毒的基因檢測(cè)，包括使用權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的CRISPR檢測(cè)體系的組分、權(quán)利要求7所述的CRISPR檢測(cè)試劑盒或權(quán)利要求8所述的CRISPR檢測(cè)可控化的方法，其中，
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種crispr檢測(cè)體系，包括crispr/cas反應(yīng)體系和靶基因擴(kuò)增體系，其中，所述crispr檢測(cè)體系還包括保護(hù)核酸序列以及保護(hù)核酸序列的破壞組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的crispr檢測(cè)體系，其中，所述crispr檢測(cè)體系包括識(shí)別靶序列的sgrna，所述保護(hù)核酸序列包括與所述sgrna至少部分互補(bǔ)的dna序列；所述保護(hù)核酸序列的破壞組分包括雙鏈特異性核酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的crispr檢測(cè)體系，其中，所述crispr檢測(cè)體系還包括cas酶、用于擴(kuò)增靶序列的特異性引物、dna聚合酶、檢測(cè)探針及反應(yīng)混合液；其中，所述cas酶選自cas12a、cas12b、其同系物、或其修飾形式中的任意一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的crispr檢測(cè)體系，其中，所述cas酶是cas12a酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的crispr檢測(cè)體系，其中，所述靶基因擴(kuò)增體系是恒溫?cái)U(kuò)增體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的crispr檢測(cè)...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：苑淞，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：京東方科技集團(tuán)股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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