【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于sers檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器及其制備方法和在ad標志物檢測中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、阿爾茨海默癥是一種持續(xù)周期非常長的神經(jīng)退行性疾病，據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會統(tǒng)計截止2022年，我國60歲以上老年人中有1000萬名ad患者，是目前世界上ad患者最多的國家，給國家、社會和患者家庭帶來了巨大的經(jīng)濟、精神負擔(dān)。然而現(xiàn)在還沒有好的藥物能逆轉(zhuǎn)、治愈該疾病，因此，早診斷，早發(fā)現(xiàn)，早干預(yù)十分重要。
2、本申請構(gòu)建一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的sers傳感器，用于血液中ad標志物p-tau181的超靈敏檢測，該標志物的定量分析，可用于ad早期診斷。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器及其制備方法和在ad標志物檢測中的應(yīng)用。
2、基于上述目的，本專利技術(shù)采取如下技術(shù)方案：
3、一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，包括修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面和帶拉曼標簽的金球dtnb-au-ab2，其中修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面的制備過程如下：
4、（1）在潔凈的基底表面，磁控濺射10nm~100nm厚度的金納米薄膜，然后在金納米薄膜表面沉積金狼牙棒結(jié)構(gòu)；
5、（2）在金狼牙棒結(jié)構(gòu)表面滴加p-tau181捕獲抗體，即得修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面；
6、帶拉曼標簽的金球dtnb-au-ab2的制備過程如下：
7、a
8、b、向金球溶液中加入dtnb溶液，得到金球-dtnb溶液，然后，通過酰胺反應(yīng)將p-tau181檢測抗體修飾到dtnb表面，即可得到帶拉曼標簽的金球dtnb-au-ab2。
9、進一步地，金狼牙棒結(jié)構(gòu)的制備過程如下：以金納米薄膜為工作電極，ag/agcl為參比電極，鉑片電極為對電極，以氯金酸和硝酸銀的混合溶液為電解液，通過恒電壓法在金納米薄膜表面電沉積，沉積時間為30s~600s，所述電沉積時施加電位為-0.1~-0.6v，混合溶液中氯金酸的濃度為0.5mmol/l~25mmol/l，硝酸銀的濃度為0.5μmol/l~50μmol/l。優(yōu)選地，混合溶液中，硝酸銀和氯金酸的摩爾比為1:50。
10、進一步地，捕獲抗體的濃度為5~15μmol/l，優(yōu)選地，捕獲抗體的濃度為10μmol/l，以基底面積計，捕獲抗體的添加量為1.5*10-5~2.0*10-4μmol/mm2，添加捕獲抗體后，需要孵育0.5~2?h。
11、進一步地，金球的制備過程如下：配制濃度為1~5?mmol/l的氯金酸溶液以及濃度為15~25?mmol/l的檸檬酸鈉溶液；將氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入檸檬酸鈉溶液，并保持沸騰狀態(tài)，繼續(xù)攪拌10~20分鐘，氯金酸和檸檬酸鈉的摩爾比為1:（1~10）。
12、進一步地，金球-dtnb溶液的過程如下：每1ml金球溶液加入（0.5~1）ml、5~15mm的二硝基苯甲酸溶液，室溫氮氣氛圍中反應(yīng)20~30小時，即得。
13、進一步地，通過酰胺反應(yīng)將p-tau181檢測抗體修飾到dtnb表面的具體過程如下：向金球-dtnb溶液中加入edc溶液和nhs溶液，活化dtnb表面羧基后，再加入p-tau181檢測抗體，35~40℃反應(yīng)1~3小時，離心去除未結(jié)合的抗體，即得。
14、進一步地，edc溶液的濃度為0.1~0.5mol/l，nhs溶液的濃度為0.01mol/l~0.1mol/l，檢測抗體的濃度為5~15μmol/l，每1ml金球-dtnb溶液需要加入50~150μl的edc溶液和nhs，以及2~15μl的檢測抗體溶液。優(yōu)選地，酰胺反應(yīng)時，edc和nhs的摩爾比為4:1。
15、上述的方法制得的基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器。
16、上述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器在檢測ad標志物p-tau181中的應(yīng)用。過程如下：
17、（1）首先在一修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面滴加2~10μl系列濃度的ad標志物標準樣，35~40℃反應(yīng)0.1~1小時，用pbs沖洗后，然后滴加dtnb-au-ab2，35~40℃孵育0.1~1小時后，用拉曼光譜儀檢測拉曼信號，以濃度的對數(shù)為橫坐標、1332cm-1處的拉曼信號強度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程；
18、（2）在另一修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面滴加2~10μl待測樣，35~40℃反應(yīng)0.1~1小時，用pbs沖洗后，然后滴加dtnb-au-ab2，35~40℃孵育0.1~1小時后，用拉曼光譜儀檢測拉曼信號，記錄在1332cm-1處的拉曼信號強度，帶入標準曲線方程，計算得出待測樣中目標ad標志物的濃度。
19、本申請中，ad標志物為p-tau181蛋白，ad標志物標準樣為p-tau181蛋白標準樣中，p-tau181蛋白的濃度依次為10fm、100fm、1pm、10?pm、100pm、1nm。
20、優(yōu)選地，檢測時，拉曼光譜儀的儀器條件為：使用氦-氖激光，激發(fā)光源波長為785nm，光譜范圍800-2000cm-1，檢測頻率為50ms，掃描時間為10s~60s，預(yù)熱時間為10min。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)勢：
22、（1）在電沉積時，通過調(diào)控金離子和銀離子的比例，從而制備出具有狼牙棒形狀的金銀納米合金結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有很好的sers性能；
23、（2）基于該sers基底，構(gòu)建了用于ad血液標志物p-tau181檢測的sers傳感器；
24、（3）?p-tau181檢測限可達1.3fm，線性范圍均為1fm-1nm；
25、（4）通過對8個臨床血液樣本的檢測，驗證了該sers傳感器的實用價值，并證實血液樣本中p-tau181的含量在ad患者和正常人之間有顯著差異。
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1.一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，包括修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面和帶拉曼標簽的金球DTNB-Au-Ab2，其中修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面的制備過程如下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，金狼牙棒結(jié)構(gòu)的制備過程如下：以金納米薄膜為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑片電極為對電極，以氯金酸和硝酸銀的混合溶液為電解液，通過恒電壓法在金納米薄膜表面電沉積，沉積時間為30s~600s，所述電沉積時施加電位為-0.1~-0.6V，混合溶液中氯金酸的濃度為0.5mmol/L~25mmol/L，硝酸銀的濃度為0.5μmol/L~50μmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，捕獲抗體的濃度為5~15μmol/L，以基底面積計，捕獲抗體的添加量為1.5*10-5~2.0*10-4μmol/mm2，添加捕獲抗體后，需要孵育0.5~2?h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，金球-DTNB溶液的過程如下：每1mL金球溶液加入（0.5~1）mL、5~15mM的二硝基苯甲酸溶液，室溫氮氣氛圍中反應(yīng)20~30小時，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，通過酰胺反應(yīng)將P-tau181檢測抗體修飾到DTNB表面的具體過程如下：向金球-DTNB溶液中加入EDC溶液和NHS溶液，再加入P-tau181檢測抗體，35~40℃反應(yīng)1~3小時，離心去除未結(jié)合的抗體，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，EDC溶液的濃度為0.1~0.5mol/L，NHS溶液的濃度為0.01mol/L~0.1?mol/L，檢測抗體的濃度為5~15μmol/L，每1mL金球-DTNB溶液需要加入50~150μL的EDC溶液和NHS，以及2~15μL的檢測抗體溶液。
8.權(quán)利要求1至7任一項所述的方法制得的基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器。
9.權(quán)利要求8所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器在檢測AD標志物P-tau181中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，過程如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，包括修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面和帶拉曼標簽的金球dtnb-au-ab2，其中修飾了捕獲抗體的金狼牙棒基底表面的制備過程如下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，金狼牙棒結(jié)構(gòu)的制備過程如下：以金納米薄膜為工作電極，ag/agcl為參比電極，鉑片電極為對電極，以氯金酸和硝酸銀的混合溶液為電解液，通過恒電壓法在金納米薄膜表面電沉積，沉積時間為30s~600s，所述電沉積時施加電位為-0.1~-0.6v，混合溶液中氯金酸的濃度為0.5mmol/l~25mmol/l，硝酸銀的濃度為0.5μmol/l~50μmol/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，捕獲抗體的濃度為5~15μmol/l，以基底面積計，捕獲抗體的添加量為1.5*10-5~2.0*10-4μmol/mm2，添加捕獲抗體后，需要孵育0.5~2?h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金狼牙棒結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼傳感器的制備方法，其特征在于，金球的制備過程如下：配制濃度為1~5?mmol/l的氯金酸溶液以及濃度為15~25?mmol/l的檸檬酸鈉溶液；將氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入檸檬酸鈉溶液，并保持沸騰狀態(tài)，繼續(xù)攪拌10~20分鐘，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉一鑣，曾昱，孫昕，張馨寧，夏萱，
申請(專利權(quán))人：深圳市龍崗中心醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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