【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及豬病原體檢測，具體而言，涉及一種豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重pcr檢測核酸組合物及檢測產品。
技術介紹
1、豬病毒性腹瀉是豬的常見多發病，其中危害最為嚴重的病原是豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬a群輪狀病毒(prva)和豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)。三種病原可感染所有日齡的豬只，均可引起嘔吐、水樣腹瀉和脫水等癥狀。對10日齡以內仔豬的危害尤為嚴重，發病率和病死率高，可達100％。因此亟需一種簡便高效可同時檢測三種病原體感染的技術產品。以下是目前常用的2種檢測技術：
2、rt-pcr:逆轉錄酶pcr(rt-pcr)是擴增靶rna的聚合酶鏈反應的一種變體，在pcr之前添加逆轉錄酶(rt)酶使擴增和檢測rna靶標成為可能。逆轉錄酶轉錄模板rna并形成互補dna(cdna)。單鏈cdna通過dna聚合酶轉化為雙鏈dna。這些dna分子現在可以用作聚合酶鏈反應的模板。
3、rt-qpcr：是應用于以rna作為起始材料的pcr實驗中的一種實驗方法。在該方法中，總rna或信使rna(mrna)首先通過逆轉錄酶轉錄成互補dna(cdna)。隨后，以cdna為模板進行qpcr(taqman探針)反應。taqman探針是由5’端標記有熒光報告基團和3’端標記有淬滅基團以及與目標基因特異性結合的寡核苷酸序列組成。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，此時儀器不會檢測到熒光信號。在pcr擴增時，模板dna變性解鏈，taqman探針特異性結合到目標基因處，而taq酶具有5’
4、現有技術rt-pcr檢測存在以下缺陷：其結果分析較為粗糙(瓊脂糖凝膠電泳)，開放式結果分析容易產生污染。而rt-qpcr檢測技術具有特異性高、檢測靈敏度高、閉管式檢測可有效防止污染。但目前商品化的試劑盒大部分為單一病毒基因的pcr擴增，并不能同時滿足于豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒三種病毒的鑒別診斷，三種病毒感染生豬的臨床癥狀又表現一致，無法快速而又準確的監測引起豬腹瀉病毒的發生樣本。
5、鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重pcr檢測核酸組合物及檢測產品以解決上述技術問題。
2、本專利技術是這樣實現的：
3、第一方面，本專利技術提供了一種豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重pcr檢測核酸組合物，其包括：如seq?id?no.1-2所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一核酸組合、如seq?id?no.4-5所示的用于檢測豬a群輪狀病毒的第二核酸組合、如seq?id?no.7-8所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三核酸組合。
4、該引物探針組合物分別是基于豬流行性腹瀉病毒的m基因、豬a群輪狀病毒的vp7基因和豬傳染性胃腸炎病毒的n基因而設計。該檢測核酸組合具有檢測特異性強、靈敏度高的技術優勢。可以滿足qpcr檢測和高分辨率熔解曲線檢測的需求。
5、當高分辨率熔解曲線檢測時，無需設置探針。高分辨率熔解曲線檢測是pcr擴增技術與溶解曲線分析技術相結合，依靠高分辨溫度檢測pcr儀和新型飽和熒光染料實現基因序列分析的技術。其原理是在pcr完成之后，直接對pcr擴增產物運行高分辨溶解程序，通過儀器檢測擴增子中飽和熒光染料的熒光強度變化，獲得特征性溶解曲線，最后根據溶解曲線的位置和形態變化來判斷序列的變異情況，能夠區分單個堿基的序列差異。
6、豬流行性腹瀉病毒(pedv)m基因的檢測核酸組合物包括如下引物探針：
7、豬流行性腹瀉病毒(pedv)m基因正向引物：5’?gctaaatggttgctcgactggtaca?3’(seq?id?no:1)
8、pedv?m基因反向引物：5’?accttcacgtccgtagacaactg?3’(seq?id?no:2)
9、pedv?m基因探針：5’?taatcgtcacagtcgttccaagtcca?3’(seq?id?no:3)
10、pedv?m引物能靈敏且特異的檢測豬流行性腹瀉病毒感染。
11、豬a群輪狀病毒(prva)vp7基因的檢測核酸組合物包括如下引物探針：
12、prva?vp7基因正向引物：5’?atccagcttccgatgtacttgac?3’(seq?id?no:4)
13、prva?vp7基因反向引物：5’?ccatattactctcgcatcattttct3’(seq?id?no:5)
14、prva?vp7基因探針：5’?acggctgatccaagcacagctcga3’(seq?id?no:6)。
15、prva?vp7引物能靈敏且特異的檢測豬a群輪狀病毒感染。
16、豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)n基因的檢測核酸組合物包括如下如下引物探針：
17、tgev?n基因正向引物：5’?ctgacctccctgccaatca?3’(seq?id?no:7)
18、tgev?n基因反向引物：5’?atgtgctagacacaggaacacattc?3’(seq?id?no:8)
19、tgev?n基因探針：5’?agtgccaagactcattacccacaggc?3’(seq?id?no:9)。
20、多重pcr檢測核酸組合物還包括如seq?id?no.3所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一探針、如seq?id?no.6所示的用于檢測豬a群輪狀病毒的第二探針、如seq?id?no.9所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三探針，且第一探針、第二探針和第三探針上均帶有熒光報告基團和熒光淬滅基團。
21、在本專利技術應用較佳的實施方式中，熒光報告基團選自5-fam、6-fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas?red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一種，熒光淬滅基團選自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb和qsy中的任意一種。
22、在本專利技術應用較佳的實施方式中，第一探針上的熒光報告基團為fam，第一探針上的熒光淬滅基團為bhq1；第二探針上的熒光報告基團為rox，第一探針上的熒光淬滅基團為bhq2，第三探針上的熒光報告基團為cy5，第一探針上的熒光淬滅基團為bhq1。
23、第二方面，本專利技術還提供了多重pcr檢測核酸組合物在制備豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重pcr檢測產品中的應用，多重本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重PCR檢測核酸組合物，其特征在于，其包括：如SEQ?ID?NO.1-2所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一核酸組合、如SEQ?ID?NO.4-5所示的用于檢測豬A群輪狀病毒的第二核酸組合、如SEQ?IDNO.7-8所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三核酸組合。
2.根據權利要求1所述的多重PCR檢測核酸組合物，其特征在于，所述多重PCR檢測核酸組合物還包括如SEQ?ID?NO.3所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一探針、如SEQ?IDNO.6所示的用于檢測豬A群輪狀病毒的第二探針、如SEQ?ID?NO.9所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三探針，且所述第一探針、第二探針和第三探針上均帶有熒光報告基團和熒光淬滅基團。
3.根據權利要求2所述的多重PCR檢測核酸組合物，其特征在于，所述熒光報告基團選自5-FAM、6-FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas?Red、Cy5、Cy5.5和Quasar670中的任意一種，所述熒光淬滅基團選
4.根據權利要求3所述的多重PCR檢測核酸組合物，其特征在于，所述第一探針上的所述熒光報告基團為FAM，所述第一探針上的所述熒光淬滅基團為BHQ1；所述第二探針上的所述熒光報告基團為ROX，所述第一探針上的所述熒光淬滅基團為BHQ2，所述第三探針上的所述熒光報告基團為CY5，所述第一探針上的所述熒光淬滅基團為BHQ1。
5.如權利要求1-4任一項所述的多重PCR檢測核酸組合物在制備豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重PCR檢測產品中的應用，其特征在于，所述多重PCR檢測產品為試劑、試劑盒、芯片或檢測儀。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述多重PCR檢測的體系中，第一核酸組合的終濃度為0.1～0.3μM，第二核酸組合的終濃度為0.1～0.3μM，第三核酸組合的終濃度為0.1～0.3μM；
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述多重PCR檢測的體系還包括qPCR?Mix和反轉錄酶；
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述多重PCR檢測的程序包括：55℃±0.5℃，15-16min；94℃±0.5℃，30s-35s，94℃±0.5℃，5s-8s，60℃±0.5℃，30s-34s，循環40-45次，采集熒光。
9.一種豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重PCR檢測產品，其特征在于，其包括：權利要求1-4任一項所述的多重PCR檢測核酸組合物，所述多重PCR檢測產品為試劑、試劑盒、芯片或檢測儀。
10.根據權利要求9所述的多重PCR檢測產品，其特征在于，所述多重PCR檢測產品還包括：qPCR?Mix和反轉錄酶，或飽和染料；
...【技術特征摘要】
1.一種豬流行性腹瀉病毒、豬a群輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的多重pcr檢測核酸組合物，其特征在于，其包括：如seq?id?no.1-2所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一核酸組合、如seq?id?no.4-5所示的用于檢測豬a群輪狀病毒的第二核酸組合、如seq?idno.7-8所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三核酸組合。
2.根據權利要求1所述的多重pcr檢測核酸組合物，其特征在于，所述多重pcr檢測核酸組合物還包括如seq?id?no.3所示的用于檢測豬流行性腹瀉病毒的第一探針、如seq?idno.6所示的用于檢測豬a群輪狀病毒的第二探針、如seq?id?no.9所示的用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的第三探針，且所述第一探針、第二探針和第三探針上均帶有熒光報告基團和熒光淬滅基團。
3.根據權利要求2所述的多重pcr檢測核酸組合物，其特征在于，所述熒光報告基團選自5-fam、6-fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas?red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一種，所述熒光淬滅基團選自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb和qsy中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的多重pcr檢測核酸組合物，其特征在于，所述第一探針上的所述熒光報告基團為fam，所述第一探針上的所述熒光淬滅基團為bhq1；所述第二探針上的所述熒光報告基團為rox，所述第一...
【專利技術屬性】
技術研發人員：高楠，吳春梅，王鵬云，劉波濤，高方鳴，王保曼，
申請(專利權)人：生工生物工程上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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