【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物檢測，具體為一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法。
技術介紹
1、棘阿米巴是一種廣泛分布于自然界的原蟲，當其感染角膜可導致棘阿米巴角膜炎，該病是嚴重的致盲性眼病，其主要臨床特點為眼部劇烈疼痛、環形角膜基質炎和角膜放射狀神經炎，而該病的診斷及治療往往比較困難。有文獻報道棘阿米巴角膜炎患者52%～88.9%為戴接觸鏡者，近年來隨著近視防控所使用的角膜塑形鏡以及成年人化妝時佩戴的美瞳類隱形眼鏡的普及，棘阿米巴角膜炎發生率逐年升高，隱形眼鏡、鏡片盒、隱形眼鏡護理液和家庭自來水中的阿米巴往往是阿米巴原蟲的來源，而及時便利的檢測可能為該疾病的發生提供有效的預防。
2、棘阿米巴原蟲感染角膜的蟲株多屬于特定基因型，其中t4型最為多見，約占總體的96%。棘阿米巴原蟲的實驗室檢查方法主要包括角膜刮片檢查、病原體培養和分子診斷。其中，角膜刮片法需要在病變角膜上采樣后行特殊染色后觀察，病原體培養則需要特殊的培養條件。而分子診斷以pcr檢測作為目前國際公認的檢測棘阿米巴原蟲的快速、敏感的方法，但該方法需要實驗室設備如pcr基因擴增儀器和專業技術人員，且完成30次以上的高溫低溫切換往往需要一小時以上，難以滿足病原微生物的快速現場檢測甚至是群眾自行居家檢測。與pcr相比，重組酶聚合酶擴增（recombinase?polymerase?amplification，rpa）技術更簡單，快速，其特異性和靈敏度與pcr相當，該技術既克服了傳統pcr技術高溫變性獲得單鏈模板的缺陷，也避免了升降溫的過
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法，該引物探針組合具有較高的靈敏度和特異性，可為床旁、居家快速檢測提供診斷依據，t4型棘阿米巴原蟲rpa-lfs的檢測方法只需要一臺水浴鍋或者手握反應管控溫即可進行檢測，減少了對實驗室條件的依賴以及人工成本，縮短了檢測時間成本，且具有較高的靈敏度和特異性，可為快速檢測提供診斷依據。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，引物設計：
3、下游引物：[5'-biotin]-gacttgatgttgttggggatccactcgac
4、探針設計：
5、探針：
6、[fitc]-tggccgagattacccagcaaatcttcgatg[dspacer]ccaagaacatcatgg?[3'c3spacer]
7、無需上游引物。
8、優選的，所述探針5’末端用fitc進行標記，3’末端引入3c-spacer進行末端封閉，在探針中間引入thf（dspacer），即無嘌呤無嘧啶位點(ap位點)。
9、優選的，所述下游引物的5’末端標記生物素biotin。
10、一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合使用方法，用于rpa-lfs特異性檢測、rpa-lfs反應溫度優化、rpa-lfs手握反應管溫度下敏感性檢測、rpa-lfs反應時間優化、rpa-lfs最低檢出限測定。
11、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
12、1.該利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法，科學有效的結合了rpa技術和lfs技術,建立了rpa-lfs現場快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的方法，建立的rpa-lfs檢測方法在20min內能夠完成檢測，與基于pcr技術的檢測方法相比，簡化了檢測條件，縮短了檢測時間。
13、2.該利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法，建立的rpa-lfs檢測方法僅需要非常微量的dna模板，目前檢測的最低dna模板用量為每個反應15.5*10-4ng，相當于pcr技術的檢測方法模板需要量的千分之一。克服了對實驗室設備的依賴性，在床旁及居家條件下可以現場檢測，只需要一臺水浴鍋或者手握反應管控溫即可進行檢測，且操作簡單，不依賴于高素質技術人員，使患者及群眾能夠進行檢測，簡化了檢測流程。
14、3.該利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法，實現了可視化檢測，通過顯色反應即可判斷檢測結果，使醫生及普通群眾可以進行結果判定，不需要借助任何儀器設施。
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1.一種利用RPA-LFS快速檢測T4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：引物設計：
2.根據權利要求1所述的一種利用RPA-LFS快速檢測T4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：所述探針5’末端用FITC進行標記，3’末端引入3C-spacer進行末端封閉，在探針中間引入THF(dSpacer)，即無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)。
3.根據權利要求1所述的一種利用RPA-LFS快速檢測T4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：所述下游引物的5’末端標記生物素Biotin。所述的引物探針組合用于T4型棘阿米巴原蟲的RPA-LFS的檢測，為最佳的引物探針組合。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的利用RPA-LFS快速檢測棘阿米巴原蟲的引物探針組合及其使用方法，其特征在于：用于T4型棘阿米巴原蟲檢測具有高度特異性、LFS結果解讀簡單直觀、RPA-LFS最佳反應溫度為36℃、RPA-LFS最佳反應時間14分鐘、RPA-LFS對T4型棘阿米巴原蟲檢測的最低檢測的模板量為每個反應15.5*10-4ng。
【技術特征摘要】
1.一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：引物設計：
2.根據權利要求1所述的一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：所述探針5’末端用fitc進行標記，3’末端引入3c-spacer進行末端封閉，在探針中間引入thf(dspacer)，即無嘌呤無嘧啶位點(ap位點)。
3.根據權利要求1所述的一種利用rpa-lfs快速檢測t4型棘阿米巴原蟲的引物探針組合，其特征在于：所述下游引...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳潔，李建航，顧雨亭，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院海南醫院，
類型：發明
國別省市：
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