【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物催化劑，特別涉及一種烯還原酶突變體及其催化制備布瓦西坦合成中間體的用途。
技術介紹
1、布瓦西坦(brivaracetam)，又稱布立西坦，化學名稱為(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酰胺，為左乙拉西坦結構類似物。布瓦西坦是由比利時優時比制藥公司(uc?pharma)研制的第三代抗癲癇藥物，可選擇性結合中樞突觸囊泡蛋白2a，調節突觸間神經遞質的釋放而起到抗癲癇作用，具有生物利用度高，安全性好等優點。
2、(r)-4-正丙基二氫呋喃-2-酮是布瓦西坦合成過程中一個關鍵的中間體，因結構簡單，五元環內酯中間體與其對映異構體的空間位阻差異較小，制備與分離均存在難度。因此，開發一種獲得高光學純度布瓦西坦中間體的不對稱催化合成新方法，仍然是一個亟待解決的問題。
3、
4、專利wo2016191435a1以(r)-環氧氯丙烷為起始原料引入手性中心，經親核取代反應、格式反應、脫羧反應得到(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮。該路線使用的原料廉價易得，但格式反應的反應條件苛刻，全程需要進行多次減壓蒸餾操作，且產物的ee為98％，仍需要進一步提高。
5、
6、專利cn105801530使用手性原料(r)-2-氨基戊酸，經溴化氫取代得到(r)-2-溴戊酸，再使用乙硼烷還原羧基，叔丁基二甲基硅基保護羥基，親核取代，脫保護，水解，酯化成環得到(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮。該路線使用了毒性較高的溴化氫與乙硼烷，具有安全隱患。
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8、專利cn106008411a使用(s)-4-芐基-2-噁唑烷酮作為手性助劑，與正戊酸和特戊酰氯反應，后在強堿作用下與溴乙酸叔丁酯反應，之后通過過氧化氫和氫氧化鋰脫除輔基噁唑烷酮。最后還原羧基，關環得到(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮。該路線需要用到-70℃的超低溫，反應條件較為苛刻。使用過氧化氫與二甲硫醚硼烷，有爆炸風險且不利于環保。
9、
10、a等人報道了一條酶拆分路線。使用丙基丙二酸二甲酯經強堿拔氫，與溴乙酸叔丁酯反應，脫羧反應得到酶催化底物。使用來自枯草芽孢桿菌的蛋白酶c的催化拆分。酶拆分產物與氯乙酸乙酯發生酯化反應，再經過還原、加酸關環得到(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮。該路線拆分收率42％，原子經濟性較差(a,merschaerta,szczepaniak?c,et?al.abiocatalytic?route?to?the?novel?antiepileptic?drugbrivaracetam[j].organic?process?research&development,2016,20(9):1566-1575.)。
11、近幾年，利用酶法不對稱加氫合成布瓦西坦中間體的方法被陸續報道。cn107604018a公開了一種烯還原酶催化4-正丙基-2(5h)-呋喃酮底物合成(r)-4-丙基二氫呋喃-2-酮的方法，但沒有公開烯還原酶序列等信息。feng?jiacheng和sun?lili等人也分別報道了一種烯還原酶制備(r)-4-丙基二氫呋喃-2-酮的方法，但底物濃度分別只有7g/l和2.5g/l(process?biochemistry?126(2023)108–116；appliedmicrobiologyandbiotechnology(2023)107:1649–1661)。此外，cn111154735a、cn109852644a、cn116948997a和cn?118028391?a等專利也公開了化學酶法制備布瓦西坦中間體的方法，但這些報道都存在底物濃度低、操作復雜、轉化率低等缺點，不適合工業化生產。
12、因此，本領域迫切需要開發環境友好、高效、高立體選擇性、更適合產業生產的制備布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法。
技術實現思路
1、鑒于現有技術的不足，本專利技術提供一種烯還原酶突變體及其催化制備布瓦西坦合成中間體的用途，可實現瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的高效、綠色制備。
2、第一方面，本專利技術提供一種烯還原酶突變體，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
3、第二方面，本專利技術提供一種核酸，編碼前述的烯還原酶突變體；優選的，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
4、第三方面，本專利技術提供一種重組表達載體，其含有前述的核酸。
5、第四方面，本專利技術提供一種重組菌株，其含有前述的重組表達載體。
6、第五方面，本專利技術提供一種復合酶，包含氨基酸序列分別如seq?id?no.1～3所示的烯還原酶突變體、羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶。
7、第六方面，本專利技術提供一種核酸組合物，包含：第一核酸：編碼前述的烯還原酶突變體；第二核酸：編碼前述的羰基還原酶；和第三核酸：編碼前述的葡萄糖脫氫酶；優選的，第一核酸、第二核酸、第三核酸的核苷酸序列分別如seq?id?no.4～6所示。
8、第七方面，本專利技術提供一種重組表達載體組合物，包含：第一重組表達載體：包含前述的第一核酸；第二重組表達載體：包含前述的第二核酸；和第三重組表達載體：包含前述的第三核酸。
9、第八方面，本專利技術提供一種重組菌株組合物，包含：第一重組菌株：包含前述的第一重組表達載體；第二重組菌株：包含前述的第二重組表達載體；和第三重組菌株：包含前述的第三重組表達載體。
10、第九方面，本專利技術提供前述烯還原酶突變體，或核酸，或重組表達載體，或重組菌株，或復合酶，或核酸組合物，或重組表達載體組合物，或重組菌株組合物在催化5-羥基-4-正丙基-2-呋喃酮合成(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮的生物催化劑中的應用。
11、第十方面，本專利技術提供一種(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮的生物催化制備方法，包括：以前述的復合酶或重組菌株組合物為催化劑，以5-羥基-4-正丙基-2-呋喃酮為底物進行生物催化；以及，將生物催化產物進行非對映異構體結晶，獲得(r)-4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮。
12、在生物催化階段，還包括使用反應助劑，包括但不限于：1)煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、葡萄糖以及磷酸緩沖液體系；2)煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、異丙醇、磷酸緩沖液體系；以及3)煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、甲酸銨、磷酸緩沖液體系。
13、非對映異構體結晶是先利用一種手性化合物與外消旋體形成非對映異構體，進而利用非對映異構體之間存在溶解度的差異，通過結晶的方法除去不需要的非對映異構體而實現拆分。優選地，通過4-丙基二氫呋喃-2(3h)-酮與(s)-苯乙胺反應得到非對映異構體再結晶除去異構體。
14、本專利技術的有益效果為：
15、本專利技術提供的烯還原酶e1的突變體m8與羰基還原酶k1、葡萄糖脫氫酶組成的復合酶，能夠以化合物5-羥基-4-正丙基-2-呋喃酮為底物，還原雙鍵與脫除羥本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種烯還原酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一種核酸，其特征在于，其編碼權利要求1所述的烯還原酶突變體。
3.根據權利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
4.一種重組表達載體，其特征在于，其含有權利要求2或3所述的核酸。
5.一種重組菌株，其特征在于，其含有權利要求4所述的重組表達載體。
6.一種復合酶，其特征在于，其包含氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.1～3所示的烯還原酶突變體、羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶。
7.一種核酸組合物，其特征在于，所述核酸組合物包含：
8.根據權利要求7所述的核酸組合物，其特征在于，所述第一核酸、第二核酸、第三核酸的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.4～6所示。
9.一種重組表達載體組合物，其包含：
10.一種重組菌株組合物，其包含：
11.權利要求1所述烯還原酶突變體，或權利要求2～3之一所述核酸，或權利要求4所述重組表達載體，或權利要求5所述重組菌株
12.一種(R)-4-丙基二氫呋喃-2(3H)-酮的生物催化制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
...【技術特征摘要】
1.一種烯還原酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種核酸，其特征在于，其編碼權利要求1所述的烯還原酶突變體。
3.根據權利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
4.一種重組表達載體，其特征在于，其含有權利要求2或3所述的核酸。
5.一種重組菌株，其特征在于，其含有權利要求4所述的重組表達載體。
6.一種復合酶，其特征在于，其包含氨基酸序列分別如seq?id?no.1～3所示的烯還原酶突變體、羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶。
7.一種核酸組合物，其特征在于，所述核酸組合物包含：
8.根據權利要求7所述的核酸組合物，其特...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳少欣，湯佳偉，陳浩，張福利，余俊，朱怡霖，張嘉偉，張露文，楊松柏，
申請(專利權)人：上海醫藥工業研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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