【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，該技術(shù)涉及用于發(fā)現(xiàn)和識(shí)別配體與受體特異性以及基因和蛋白質(zhì)傳遞的方法和組合物。具體而言，涉及一種用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞、及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、t細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。t細(xì)胞表面有一種特定的受體，稱為t細(xì)胞受體(tcr)，用于識(shí)別抗原。
2、mhc在小鼠中稱為主要組織相容性復(fù)合體(mhc)，在人類中稱為人類白細(xì)胞抗原(hla)。mhc/hla是細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)復(fù)合體，用于呈遞抗原肽(短的蛋白質(zhì)片段)。癌細(xì)胞在其代謝過程中會(huì)產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被分解成肽段。這些肽段被細(xì)胞內(nèi)部的蛋白酶處理后，通過細(xì)胞內(nèi)的加工機(jī)制被裝載到mhc/hla分子上，并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面。當(dāng)t細(xì)胞在巡邏體內(nèi)時(shí)，tcr會(huì)掃描細(xì)胞表面的mhc/hla分子。如果tcr識(shí)別并與mhc/hla呈遞的特定抗原肽緊密結(jié)合，這通常意味著該細(xì)胞表現(xiàn)出異常的或非自我的標(biāo)志，例如癌細(xì)胞標(biāo)志。這種結(jié)合觸發(fā)t細(xì)胞激活。激活后的t細(xì)胞可以釋放細(xì)胞因子、繁殖并分化為效應(yīng)t細(xì)胞(如細(xì)胞毒性t細(xì)胞)。這些效應(yīng)t細(xì)胞有能力直接攻擊并殺死呈遞癌性抗原的細(xì)胞。因此，t細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)可以引發(fā)抗原導(dǎo)向的細(xì)胞毒性，并且在抗癌過程中起著關(guān)鍵作用。
3、基于這一原理，科學(xué)家開發(fā)了一些免疫療法。例如：car-t細(xì)胞療法：患者的t細(xì)胞被從體內(nèi)提取、在實(shí)驗(yàn)室中被修改以表達(dá)特定的嵌合抗原受體(car)，這種受體能夠識(shí)別癌細(xì)胞表面的特定抗原。修改后的t細(xì)胞被擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強(qiáng)其識(shí)別和
4、tcr-t細(xì)胞療法：與car-t類似，但t細(xì)胞被改造以表達(dá)特定的tcr，這種tcr能夠識(shí)別與癌癥相關(guān)的特定抗原-mhc/hla復(fù)合物。這些改造后的t細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，能夠有效識(shí)別并攻擊癌細(xì)胞，減少腫瘤負(fù)擔(dān)并延長患者生存期。
5、細(xì)胞通過配體-受體相互作用傳導(dǎo)信號(hào)。豐富的細(xì)胞間通信塑造了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分子程序，以指導(dǎo)特定行為和細(xì)胞命運(yùn)決策。例如，t細(xì)胞表面上的tcr可以識(shí)別并與抗原呈遞細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物(mhc)-抗原復(fù)合物相互作用。tcr和抗體基因經(jīng)歷體細(xì)胞重組以達(dá)到一個(gè)龐大且多樣的庫(在人類中約有1016個(gè)tcr?alpha和beta序列)，抗原特異性的t細(xì)胞和b細(xì)胞擴(kuò)增分化高度依賴tcr和bcr的特異性。解析tcr-抗原相互作用，特別是將特異性抗原對(duì)應(yīng)到特異性tcr序列和t細(xì)胞狀態(tài)對(duì)于理解抗原識(shí)別如何驅(qū)動(dòng)t細(xì)胞命運(yùn)決策至關(guān)重要。
6、研究者已經(jīng)開發(fā)了各種方法來解讀tcr的抗原特異性，包括:(1)細(xì)胞報(bào)告基因分析，使用人工apcs篩選t細(xì)胞特異性mhc-抗原，如t-scan、sabr、t細(xì)胞吞噬作用和細(xì)胞因子捕獲分析(joglekar等，2019年；kula等，2019年；lee?and?meyerson，2021年；li等，2019年)；(2)酵母展示平臺(tái)，用于篩選用于重組tcr的mhc-抗原(birnbaum等，2012年)；(3)基于t細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，如抗原肽刺激后的細(xì)胞因子產(chǎn)生(elispot)(mccutcheon等，1997年)；(4)使用dna條形碼的mhc-肽多聚體，通過單細(xì)胞測(cè)序捕獲抗原特異性和tcr序列(tettcr-seq；zhang等，2018年)。盡管每種技術(shù)各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但快速篩選初始t細(xì)胞對(duì)mhc-抗原的免疫原性并同時(shí)捕獲抗原對(duì)應(yīng)的tcr庫和t細(xì)胞基因表達(dá)特征仍然具有挑戰(zhàn)性。許多現(xiàn)有方法需要在異質(zhì)細(xì)胞上重新表達(dá)受體或配體，因此不能直接應(yīng)用于人類臨床樣本。類似的挑戰(zhàn)也適用于研究b細(xì)胞受體-抗原相互作用，其面臨的額外挑戰(zhàn)是解決抗體識(shí)別的已知細(xì)胞內(nèi)抗原表位。
7、盡管在表征抗原特異性的t細(xì)胞和b細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)方面取得了巨大進(jìn)展，但在不干擾其他旁觀者t細(xì)胞或b細(xì)胞的情況下有選擇地重構(gòu)它們的細(xì)胞狀態(tài)和行為仍具有很大挑戰(zhàn)性。最近的一種方法使用呈現(xiàn)pmhc的納米粒子已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在特定抗原t細(xì)胞中的mrna傳遞，為瞬態(tài)調(diào)節(jié)特定t細(xì)胞提供了許多可能性(su等人，2022)。另一項(xiàng)最新研究使用呈現(xiàn)pmhc偽型病毒允許對(duì)特定抗原t細(xì)胞進(jìn)行基因修改(guo和elledge，2022)。然而，仍然缺乏一種技術(shù)，可以選擇性地操縱特定b細(xì)胞而不僅限于特定t細(xì)胞。
8、目前，通過ngs和mhc-肽結(jié)合預(yù)測(cè)算法可以預(yù)測(cè)潛在的新抗原肽，但這些方法的效率仍存在爭議，存在效率低的問題。質(zhì)譜法可用于鑒定腫瘤細(xì)胞呈遞的新抗原，但由于高背景和腫瘤組織數(shù)量限制，其臨床應(yīng)用有限。
9、此外，現(xiàn)有技術(shù)需要將全部的hla編碼基因和抗原肽通過連接子連接從而構(gòu)建慢病毒載體，轉(zhuǎn)染后獲得細(xì)胞表面表達(dá)hla分子-多肽復(fù)合物；由于hla-多肽復(fù)合物是融合連接表達(dá)的，不能有效反映體內(nèi)的天然構(gòu)象hla-多肽復(fù)合物的遞呈。此外，hla融合表達(dá)配體的策略進(jìn)一步限制了慢病毒的基因裝載長度。這些不足進(jìn)一步限制了在精確地、高效地標(biāo)記或識(shí)別特異性t細(xì)胞等方面的應(yīng)用。
10、鑒于此，特提出本專利技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞、及其制備方法和應(yīng)用以解決上述技術(shù)問題。
2、本專利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，其包括如下步驟：
4、s1：構(gòu)建單一hla基因的細(xì)胞系：
5、以hla全敲除以及tap1不表達(dá)的細(xì)胞為底盤細(xì)胞，將攜帶單一hla編碼基因的慢病毒感染底盤細(xì)胞，獲得含有單一hla基因但細(xì)胞表面不表達(dá)hla分子的細(xì)胞系；
6、s2：構(gòu)建包括配體編碼基因和靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽序列的慢病毒載體，然后將包括配體編碼基因和靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽序列的慢病毒感染單一hla基因的細(xì)胞系，培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞分選，獲得細(xì)胞表面為hla陽性的細(xì)胞，細(xì)胞表面為hla陽性的細(xì)胞展示天然構(gòu)象的hla特定多肽復(fù)合物。
7、第二方面，本專利技術(shù)還提供了一種帶有標(biāo)記的用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，取上述的方法制得用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞，與帶有標(biāo)記基因的質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。
8、第三方面，本專利技術(shù)還提供了由上述方法制備的用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞，或，由上述制備方法制備的帶有標(biāo)記的用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞。
9、第四方面，本專利技術(shù)還提供了慢病毒或細(xì)胞在t細(xì)胞標(biāo)記、t細(xì)胞激活、識(shí)別或鑒定b細(xì)胞受體的抗原、鑒定b細(xì)胞受體或抗體、識(shí)別或鑒定t細(xì)胞受體和成對(duì)pmhc、鑒定免疫原表位、鑒定目的細(xì)胞中的核酸或蛋白、鑒定配體受體對(duì)或制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10、本專利技術(shù)具有以下有益效果：
11、本專利技術(shù)提供了能展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，該方法利用慢病毒技術(shù)，以hla及tap1不表達(dá)的細(xì)胞為底盤細(xì)胞，先獲得含有單一hla基因但細(xì)胞表面不本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于展示天然構(gòu)象的HLA多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述配體為表位或蛋白質(zhì)；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中，以TAP1、HLA不表達(dá)以及如下至少一種蛋白不表達(dá)的細(xì)胞為底盤細(xì)胞：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中，構(gòu)建的慢病毒載體中的配體編碼基因包括腫瘤突變位點(diǎn)編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2包括先進(jìn)行包括配體編碼基因和靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽序列的慢病毒包裝，所述慢病毒包裝包括：將所述慢病毒載體、輔助質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒與宿主細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
7.一種帶有標(biāo)記的用于展示天然構(gòu)象的HLA多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，其特征在于，取權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法制得用于展示天然構(gòu)象的HLA多肽的慢病毒或細(xì)胞，與帶有標(biāo)記基因的質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；
8.如權(quán)
9.如權(quán)利要求8所述的慢病毒或細(xì)胞在T細(xì)胞標(biāo)記、T細(xì)胞激活、識(shí)別或鑒定B細(xì)胞受體的抗原、鑒定B細(xì)胞受體或抗體、識(shí)別或鑒定T細(xì)胞受體和成對(duì)pMHC、鑒定免疫原表位、鑒定目的細(xì)胞中的核酸或蛋白、鑒定配體受體對(duì)或制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述識(shí)別或鑒定T細(xì)胞受體和成對(duì)pMHC的應(yīng)用方式包括：pMHC在慢病毒表面顯示，宿主細(xì)胞包括針對(duì)pMHC的T細(xì)胞受體、一個(gè)與慢病毒的結(jié)構(gòu)蛋白連接的報(bào)告蛋白和一個(gè)帶有接頭序列的RNA，所述報(bào)告蛋白由所述標(biāo)記基因編碼；將所述慢病毒與細(xì)胞群體混合；根據(jù)報(bào)告蛋白的存在對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行分類，從而鑒定T細(xì)胞受體；所述結(jié)構(gòu)蛋白為核衣殼蛋白；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述配體為表位或蛋白質(zhì)；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟s1中，以tap1、hla不表達(dá)以及如下至少一種蛋白不表達(dá)的細(xì)胞為底盤細(xì)胞：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟s2中，構(gòu)建的慢病毒載體中的配體編碼基因包括腫瘤突變位點(diǎn)編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟s2包括先進(jìn)行包括配體編碼基因和靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽序列的慢病毒包裝，所述慢病毒包裝包括：將所述慢病毒載體、輔助質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒與宿主細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
7.一種帶有標(biāo)記的用于展示天然構(gòu)象的hla多肽的慢病毒或細(xì)胞的制備方法，其特征在于，取權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法制得用于展示天然構(gòu)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳明，陶永輝，楊琳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海善生實(shí)業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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