【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物藥品制造領(lǐng)域，特別涉及一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、肝細胞癌?(hcc)?是癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因?。絕大多數(shù)?hcc?患者在初次就診時即為晚期。肝臟是人體重要器官之一，參與體內(nèi)消化、排泄、解毒和免疫調(diào)節(jié)等過程，因此肝臟也是人體最易受損的器官之一。然而，肝癌等疾病導(dǎo)致了大量的死亡，嚴(yán)重威脅人類的健康。
2、目前，肝癌治療的方法主要包括化學(xué)治療、放射療法、外科手術(shù)、光動力學(xué)治療等。發(fā)展比較早且使用廣泛的治療方法是化學(xué)治療和放射療法，其主要缺點在于：治療手段對癌細胞的靶向性不高，不能有效區(qū)分癌細胞和正常細胞，特別是化療及一些蛋白質(zhì)藥物具有很高的細胞毒性，在治療的同時也對正常機體器官造成很大損傷。按照傳統(tǒng)的給藥方式，小分子藥物在體內(nèi)隨機分布，真正蓄積到病患部位進而發(fā)揮藥效的只是少部分藥物，多數(shù)都被代謝排出體外，生物利用度很低。
3、申請?zhí)?02211083048.4的專利技術(shù)專利公開了一種靶向肝癌細胞的ph和gsh雙響應(yīng)型納米藥物載體及其制備方法。采用自制的親水性含半乳糖聚合物作為可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（raft）反應(yīng)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑或原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（atrp）反應(yīng)大分子引發(fā)劑，通過12-冠醚-4輔助的無皂乳液活性聚合制備得到具有核殼結(jié)構(gòu)且粒徑小于100nm的納米載體，殼層聚合物鏈上的半乳糖基團可以主動靶向肝癌細胞，核層進一步水解后得到ph/gsh雙響應(yīng)型納米藥物載體。該納米載體可以作為凍干粉儲存，納米載體的尺寸不僅有助于細胞的內(nèi)吞，而且核層和殼層都
4、上述技術(shù)的制造過程較為麻煩，肝細胞癌（hcc）為了滿足自身高增殖代謝需求會增加鐵的攝取，吸收的鐵一部分用于生長所消耗，過多的鐵則會被轉(zhuǎn)運、貯存至鐵蛋白以避免過剩游離鐵對自身的氧化損傷。現(xiàn)需要一種技術(shù)能夠破壞肝癌細胞鐵蛋白，增加其內(nèi)游離鐵濃度可以誘發(fā)鐵死亡效應(yīng)達到腫瘤治療目的。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法及其應(yīng)用，能夠破壞肝癌細胞鐵蛋白，增加其內(nèi)游離鐵濃度可以誘發(fā)鐵死亡效應(yīng)達到腫瘤治療目的。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本申請?zhí)峁┤缦录夹g(shù)方案：
3、一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，包括以下步驟：
4、s1：通過改進的雙乳化法將液氣相變材料?pfh?包裹在?plga?中構(gòu)建?pp?nps；
5、s2：通過改進的雙乳化法通過plga構(gòu)建p?nps;
6、s3：通過碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)將鐵蛋白歸巢肽?hkn15共價鍵合到?pp?np?表面，得到kpp?nps；
7、s4：所得的?kpp?nps?用去離子水洗滌。去除微反應(yīng)物質(zhì)。
8、進一步，還需對制備的納米粒進行標(biāo)記，在步驟s1和s2中加入?dii?或?dir。
9、進一步，對制得的kpp?nps典型質(zhì)子進行質(zhì)量檢測，其中化學(xué)位移通過?f-nmr評估、化學(xué)鍵的變化通過?ftir評估、dls用于測量?nps?的平均流體動力學(xué)直徑和?zeta?電位，將?pp?和?kpp?nps?懸浮在?pbs?中以觀察粒徑的變化、sem和?tem觀察?kpp?nps?的形態(tài)。
10、進一步，還需對制備的納米粒進行試驗，試驗步驟為：
11、a1：培養(yǎng)試驗用的hcc細胞：
12、a2：選擇6～8周齡的小鼠作為試驗對象；
13、a3：通過在右下肢皮下注射懸浮于100?μl?pbs中的5×106個hcc細胞，培養(yǎng)出帶有hcc的c57bl/6j小鼠；
14、a4：持續(xù)觀察注射hcc細胞的小鼠皮下腫瘤大小，在注射閾值時間后，將小鼠隨機分成不同的組別。
15、進一步，步驟a1中的肝癌細胞培養(yǎng)方法為：hcc?細胞在?37℃?的加濕?5%?co2?環(huán)境中用含有?10%?胎牛血清、100?mg?ml?1鏈霉素和青霉素的?dmem?培養(yǎng)。
16、進一步，還包括納米粒的細胞內(nèi)攝取和鐵蛋白靶向：首先檢測肝癌細胞中的nps的細胞內(nèi)化情況；然后觀察鐵蛋白與pp和kpp?nps的共定位；將dir標(biāo)記的pp和kpp?nps懸浮液注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，利用體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測注射后2、6、10、24、48?h的熒光信號，并進行分析。
17、進一步，還包括鐵蛋白破壞及鐵死亡誘導(dǎo)：用?hsf?體外模擬鐵蛋白，使用比色鐵測定試劑盒評估從?hsf?中排出的鐵含量；通過?wb?評估三種處理pbs、kpp、kpp?+?lifu的hcc?細胞中的鐵蛋白表達水平；用?sem?觀察不同功率強度下?lifu?+?kpp?處理細胞后的微觀結(jié)構(gòu)形貌。
18、一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒的應(yīng)用，包括通過上述制備方法制備的納米粒。
19、本方案的基本原理及有益效果：在方案中，構(gòu)建了一種精確靶向腫瘤鐵蛋白并受低強度聚焦超聲?(lifu)?控制的?nps，即?hkn15@plga-pfh?(kpp)，以時空選擇性地破壞hcc?細胞中的鐵蛋白以誘導(dǎo)鐵死亡。采用聚乳酸羥基乙酸?(plga)?作為載體，它具有極好的納米級生物效應(yīng)、高生物相容性和易于表面改性等特征。adv?響應(yīng)材料全氟己烷?(pfh)包裹在?plga?中作為核心。將鐵蛋白歸巢肽?hkn15(hknkgkkngkhngwk)?嫁接到?plga?外殼上作為導(dǎo)航器來識別和靶向鐵蛋白。hkn15已被證明具有顯著的鐵蛋白靶向能力，通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可以實現(xiàn)溶酶體逃逸，幫助nps到達細胞質(zhì)。通過hkn15的正反饋作用和鐵蛋白的過表達，kpp?nps大量積聚在鐵蛋白周圍。然后通過外部lifu精確控制adv效應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細胞和鐵蛋白降解。隨著鐵池破壞，細胞鐵的聚集增強會誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生。總的來說，本方案提出了一種新的可控方法來靶向破壞鐵蛋白穩(wěn)態(tài)，為臨床治療hcc提供潛在創(chuàng)新方法。本方案成功構(gòu)建了精準(zhǔn)靶向腫瘤鐵蛋白、時空lifu調(diào)控的納米粒子。除了直接殺死腫瘤細胞外，隨著腫瘤鐵蛋白的崩解，細胞鐵的聚集增強，通過鐵催化的氧化還原穩(wěn)態(tài)紊亂誘導(dǎo)鐵死亡以達到腫瘤治療目的。因此，kpp?nps與lifu聯(lián)用是可行的，并提出了一種治療hcc有前景的臨床策略，且無全身毒副作用。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還需對制備的納米粒進行標(biāo)記，在步驟S1和S2中加入?DiI?或?DiR。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：對制得的KPP?NPs典型質(zhì)子進行質(zhì)量檢測，其中化學(xué)位移通過?F-NMR評估、化學(xué)鍵的變化通過?FTIR評估、DLS用于測量?NPs?的平均流體動力學(xué)直徑和?zeta?電位，將?PP?和?KPPNPs?懸浮在?PBS?中以觀察粒徑的變化、SEM和?TEM觀察?KPP?NPs?的形態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還需對制備的納米粒進行試驗，試驗步驟為：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：步驟A1中的肝癌細胞培養(yǎng)方法為：HCC?細胞在?37℃?的加濕?5%?CO2?環(huán)境中用含有10%?胎牛血清、100?mg?mL?1?鏈霉
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還包括納米粒的細胞內(nèi)攝取和鐵蛋白靶向：首先檢測肝癌細胞中的NPs的細胞內(nèi)化情況；然后檢測觀察蛋白與PP和KPP?NPs的共定位；將DiR標(biāo)記的PP和KPP?NPs懸浮液注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，利用體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測注射后2、6、10、24、48?h的熒光信號，并進行分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還包括鐵蛋白破壞及鐵死亡誘導(dǎo)：用?HSF?體外模擬鐵蛋白，使用比色鐵測定試劑盒評估從?HSF?中排出的鐵含量；通過?WB?評估三種處理PBS、KPP、KPP?+?LIFU的?HCC?細胞中的鐵蛋白表達水平；用?SEM?觀察不同功率強度下?LIFU?+?KPP?處理細胞后的微觀結(jié)構(gòu)形貌。
8.一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒的應(yīng)用，其特征在于：包括權(quán)利要求1～7任一項制備方法制備的納米粒。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還需對制備的納米粒進行標(biāo)記，在步驟s1和s2中加入?dii?或?dir。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：對制得的kpp?nps典型質(zhì)子進行質(zhì)量檢測，其中化學(xué)位移通過?f-nmr評估、化學(xué)鍵的變化通過?ftir評估、dls用于測量?nps?的平均流體動力學(xué)直徑和?zeta?電位，將?pp?和?kppnps?懸浮在?pbs?中以觀察粒徑的變化、sem和?tem觀察?kpp?nps?的形態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：還需對制備的納米粒進行試驗，試驗步驟為：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于破壞肝癌細胞鐵蛋白的納米粒制備方法，其特征在于：步驟a1中的肝癌細胞培養(yǎng)方法為：hcc?細胞在?37℃?的加濕?5%?co2?環(huán)境中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王俊銳，劉博，程婕，郭大靜，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。