【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及新型cas12a核酸酶-best10及其應用。
技術介紹
1、crispr(clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats)系統按同源性可分為class1和class2。class1包括type?i，type?iii和type?iv，class2包括type?ii，type?v和type?vi。class2最明顯的特點在于，由單一cas蛋白(crispr-associated?protein)與crrna(crispr?rna)形成復合體，行使靶向切割功能，操作更為簡單(如圖1)。class2系統雖然只有單一的效應蛋白，但是已發現的不同type的效應蛋白其蛋白分子量、結構域、crrna，以及pam(protospacer-adjacent?motif)偏好性和核酸切割方式都有明顯區別，為基因編輯提供了更加靈活的選擇。例如我們所熟知的cas9，cas12，cas13a，都屬于class2(makarova?et?al.,2020)。相比于zfn(zinc-finger?nucleases)與talen(transcription?activator-like?effector?nucleases)等基因編輯技術，crispr/cas系統具有良好的特異性、更廣的靶向性、步驟簡單、可同時編輯多位點、成本低等明顯的優勢(單奇偉,2015)。
2、2015年，首次報道了cas12a新型核酸酶可在單鏈向導rna引導下與靶dna特定位點
3、此外，研究發現cas12，cas13家族的cas蛋白在發揮特異性切割作用后，會激活其非特異的附帶切割活性(chen?et?al.,2018；liu?et?al.,2017)。如果在反應體系中加入熒光淬滅的短核苷酸分子，被激活的cas蛋白就會非特異的切割這些短核苷酸分子，釋放熒光信號，達到檢測靶向序列的目的。crispr/cas系統憑借其獨特的dna或rna特異性切割及非特異性附帶切割活性，成功在核酸檢測方面得到了廣泛的應用(zhu?et?al.,2020)。
4、crispr/cas系統作為原核生物的獲得性免疫機制，具有rna介導的核酸內切酶活性。最早發現的可以用于基因編輯的是由crrna及tracrrna介導的cas9系統(jinek?etal.,2012a)。該系統通過某些cas蛋白，主要為cas1和cas2捕獲噬菌體病毒dna或外源質粒dna，將其插入自有正向重復序列形成crispr序列。crispr序列轉錄為pre-crrna，經加工修飾成為crrna與cas9形成rnp，具有rna導向的dna內切酶活性(如圖2)。當細菌再次感染該病毒時，入侵的dna可以被靶向切割，此過程還需要tracrrna(trans-activating?crrna)的參與和特異性識別的pam的存在(barrangou?et?al.,2007)。crispr/cas系統因為其rna介導的核酸內切酶活性而被廣泛應用于基因編輯。
5、從jennifer?anna?doudna實驗室首先證明cas9的基因編輯活性，到張峰實驗室將其應用于哺乳動物細胞基因編輯，再到利用cas13a/cas12a的附屬切割活性開發的核酸檢測方法：sherlock(specific?high-sensitivity?enzymatic?reporter?unlocking)與detectr(endonuclease?targeted?crispr?trans?reporter)(cong?et?al.,2013；jineket?al.,2012b；joung?et?al.,2020；patchsung?et?al.,2020)。尤其在爆發新型冠狀病毒疫情后，以crispr/cas系統核酸檢測為基礎的病原檢測研究快速崛起。例如jennifer?annadoudna實驗室基于rpa(recombinase?polymerase?amplification)和cas12a的ssdna附帶切割活性的detectr平臺；feng?zhang實驗室基于lamp(loop-mediated?isothermalamplification)和lwacas13a的ssrna附帶切割活性的sherlockv2試劑盒；以及吐露港生物科技的holmes(one-hour?low-cost?multipurpose?highly?efficient?system)方法(如圖3)。
6、crispr技術發展迅速，可以應用于細菌，古菌和真核細胞的的基因編輯，但也暴露出許多問題(doudna?and?charpentier,2014)。crispr/cas系統識別靶向序列嚴重依賴于pam序列的存在，pam的局限性大大限制了其在細胞編輯和核酸檢測的應用范圍(walton?etal.,2020)。其次，對于脫靶率的問題，特異性低導致的脫靶效應以及大片段刪除和復雜的基因重組，還需要加以重視(kosicki?et?al.,2018；鄭武,2015)。盡管目前工程化改造的crispr/cas系統在特異性方面有了顯著的提升，并已經應用于基因治療，例如β型地中海貧血和鐮刀型細胞貧血病，但是其pam的局限性依然制約可應用范圍(papizan?et?al.,2020；slaymaker?et?al.,2016；traxler?et?al.,2016)。目前商業化的cas蛋白主要有受到3’端pam?ngg的限制的spcas9和受5’端pam?tttn的限制的lbcas12a/ascas12a(jinek?et?al.,2012b；jinek?et?al.,2014；yamano?et?al.,2016)。cas12a系統t-rich?pam依賴性極大限制其在基因編輯與核酸檢測中的應用。
7、對于基于crispr/cas系統的病原檢測方法來說，目標序列必須是保守的，否則當該病原體在該序列發生突變時，檢測方法會失去作用。例如針對新型冠狀病毒的檢測，可供選擇的位點非常有限，根據國家生物信息中心統計數據，新型冠狀病毒已經產生了超過29410個單核苷酸變異位(如圖4)。因為各cas蛋白對不同核苷酸序列的切割效率有差別，以及pam的限制，一種cas蛋白在僅有的可供選擇位點上可能難以達到較高的切割效率，進而影響檢測的靈敏度。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種新型cas12a核酸酶-best10及其應用。
2、第一方面，本專利技術要求保護一種crispr-cas12a系統。
【技術保護點】
1.CRISPR-Cas12a系統，包括：
2.根據權利要求1所述的CRISPR-Cas12a系統，其特征在于：所述PAM基序不為TTTN，N為A或T或C或G。
3.用于基因編輯的組合物，選自如下任一項：
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于：所述PAM基序不為5’TTTN，N為A或T或C或G。
5.一種用于核酸檢測的組合物，包括：
6.如下任一方法：
7.如下任一應用：
8.如下任一應用：
9.一種用于檢測COVID-2019的試劑盒，包括
10.權利要求9所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有COVID-2019的非疾病診斷性應用。
【技術特征摘要】
1.crispr-cas12a系統，包括：
2.根據權利要求1所述的crispr-cas12a系統，其特征在于：所述pam基序不為tttn，n為a或t或c或g。
3.用于基因編輯的組合物，選自如下任一項：
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于：所述pam基序不為5’tttn，n為a或...
【專利技術屬性】
技術研發人員：祁琛，李岸多，章文蔚，申雪純，劉傳，藍虹霞，黃蕾，李百濤，江媛，王歐，鄭越，
申請(專利權)人：深圳華大生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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