【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及檢測基因的試劑，尤其涉及與肺癌相關的甲基化基因及其檢測試劑盒。
技術介紹
1、肺結節為小的局灶性、類圓形、影像學表現密度增高的陰影，可單發或多發，不伴肺不張、肺門腫大和胸腔積液。形成肺部結節的病因很多，基本分為良性結節和惡性結節兩大類，良性結節為良性腫瘤、結核病、結節病或炎性結節等。惡性結節包括肺癌及轉移性腫瘤等，肺癌的發生經歷增生-不典型增生-原位癌-浸潤性癌等一系列階段，其規律是起初發展較慢，待發展到一定階段速度迅速增加。
2、惡性肺結節中肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，根據2017年2月，國家癌癥中心發布的中國最新癌癥數據可知，肺癌的發病率、死亡率雙率第一(大中小城市的肺癌死亡率都在40％～54％之間)，是第二名其它癌癥雙率的一倍左右，死亡率之高，位居2017年癌癥之首。
3、對于肺癌，早期診斷及早期治療是改善預后的最有效方法，如果及早處理，早期肺癌患者可以期待更高的5年生存率，目前i期肺癌5年總體生存率可達80％。然而相對于早期肺癌患者，進展期肺癌的患者臨床結局就差的多，甚至iv期的肺癌患者，總體5年生存率僅為10％左右。因此，有效地對肺部結節進行鑒別診斷，快速明確其良惡性，盡早切除惡性結節，同時避免不必要的過度治療，是肺部結節診斷治療的關鍵。
4、近年來肺癌表觀遺傳學研究進展對肺癌的早期診斷和治療具有深遠的意義。有證據表明抑癌基因啟動子cpg島高度甲基化是基因失活的一個重要機制，不同基因的轉錄失活將影響細胞周期、dna修復、細胞凋亡等，與癌癥的發生發展有著密切聯系。基因
5、甲基化基因標志物在良惡性肺結節鑒別和肺癌診斷中有著重要意義。目前已報道的肺癌相關的甲基化基因標志物尚具敏感度低(35.5％)和特異性低(73％)的缺陷，使之應用于臨床檢測存在一定的局限。在此，需要簡單介紹一下相關知識：甲基化基因標志物針對某一或某些癌癥的敏感度高，表示相應癌癥的漏診率低；類似地，其特異性高則表示相應癌癥的誤診率低。故可知，甲基化基因標志物檢測的敏感度、特異性是衡量其參考價值大小的兩項重要指標。綜上所述，對甲基化基因標志物進行進一步深入研究，找到高敏感度、高特異性的與肺癌相關的甲基化基因及其組合的檢測試劑，從而為良惡性肺結節鑒別或肺癌診斷的準確性和良好預后提供更有效的手段，是當前甲基化基因標志物檢測技術中亟待解決的問題。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是提供一種與肺癌相關的甲基化基因及其檢測試劑盒，能夠通過其高敏感度、高特異性為良惡性肺結節鑒別或肺癌診斷提供有價值的參考信息。
2、為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種與肺癌相關的甲基化基因，包括hoxa7、hoxa9、sct以及shox2基因中的一個或多個，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其中，基因hoxa7、hoxa9、sct以及shox2的甲基化胞嘧啶位點依次標定在序列1、序列2、序列3及序列4中。
3、為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種如前所述基因的檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中的甲基化基因，包括以下試劑中的一種或多種：
4、檢測hoxa7基因的試劑，含編號1-1、1-2序列所示的引物以及編號1-3序列所示的探針；
5、檢測hoxa9基因的試劑，含編號2-1、2-2序列所示的引物以及編號2-3序列所示的探針；
6、檢測sct基因的試劑，含編號3-1、3-2序列所示的引物以及編號3-3序列所示的探針；含編號3-4、3-5序列所示的引物以及編號3-6序列所示的探針；
7、檢測shox2基因的試劑，含編號4-1、4-2序列所示的引物以及編號4-3序列所示的探針。
8、優選地，檢測試劑盒還包括用于內參基因檢測的actb引物和探針。
9、優選地，待測樣本包含人體血液、肺泡灌洗液、肺泡沖洗液、痰液及肺部組織樣本中的一種或多種，此外，還包含支氣管刷檢樣本。
10、優選地，hoxa7、hoxa9、sct以及shox2基因相應的引物組分別由各自試劑中含有的引物及探針組成，在pcr反應液里各成分濃度依次為：0.2μm基因相應的引物組，0.6μmactb引物和探針，3.5mm?mgcl2、0.25mm?dntp；此外，還含有用量為100u的dna聚合酶，用于陽性對照的非小細胞hcc827細胞系計數后提取的dna，以及用于陰性對照的滅菌水。
11、優選地，將檢測試劑盒的試劑中的任意兩個進行組合，或將試劑中的任意三個進行組合，或將四個試劑進行組合，分別構成組合試劑盒。
12、優選地，hoxa7、hoxa9、sct以及shox2基因相應的引物組分別由各自試劑中含有的引物及探針組成，在pcr反應液里各成分濃度依次為：組合中的基因相應的引物組均設為0.2μm，0.6μmactb引物和探針，3.5mm?mgcl2、0.25mm?dntp；此外，還含有用量為100u的dna聚合酶，用于陽性對照的非小細胞hcc827細胞系計數后提取的dna，以及用于陰性對照的滅菌水。
13、為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種獲取如前所述基因的方法，包括：
14、對待測樣本進行全基因組甲基化陣列分析，篩選出的與良惡性肺結節鑒別或肺癌相關的159種候選基因；
15、從候選基因中選出靶標基因hoxa7、hoxa9、sct、shox2，分別針對靶標基因的甲基化dna特異性片段設計相應的引物和探針，設計的引物和探針分別等同于、互補于或雜交于序列表序列1-4中至少15個連續核苷酸或其互補序列，獲取并驗證符合檢測要求的靶標基因的性能指標。
16、優選地，該方法中提到的靶標基因的性能指標包括：敏感度、特異性及接受者操作特征曲線下面積auc值。
17、優選地，該方法中提到的待測樣本包含人體血液、肺泡灌洗液、肺泡沖洗液、痰液、肺部組織及支氣管刷檢樣本中的一種或多種。
18、本專利技術提供的與肺癌相關的甲基化基因及其檢測試劑盒，由于試劑盒里的試劑包括hoxa7、hoxa9、sct、shox2四種甲基化基因標志物中的一種或多種相應的引物組，通過對檢測樣本進行全基因組甲基化陣列分析，從篩選出159個候選基因中甄選出的具特殊位點的甲基化基因標志物，其敏感度、特異性之高是已有的甲基化基因檢測所不具備的，并且將這四種甲基化標志物進行不同的組合，可進一步提高其敏感度、特異本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種與肺癌相關的甲基化基因的檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中的甲基化基因，所述試劑盒包括選自以下試劑中的一種或多種：
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，還包括用于內參基因檢測的ACTB引物和探針。
3.根據權利要求1或2所述的檢測試劑盒，所述待測樣本包含選自人體血液、肺泡灌洗液、肺泡沖洗液、痰液及肺部組織樣本和支氣管刷檢樣本中的一種或多種。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒中包括的組分用于配制PCR反應液，所述PCR反應液包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒包括選自(a)-(d)中的任意兩種。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒包括選自(a)-(d)中的任意三種。
7.按照權利要求5或6所述的試劑盒，其中所述檢測試劑盒中包括的組分用于配制PCR反應液，所述PCR反應液包括：
8.一種用于制備權利要求1-7中任一項所述的檢測試劑盒的方法，包括：
9.按照權利要求8所述的
10.按照權利要求8或9所述的方法，其中所述待測樣本包含選自人體血液、肺泡灌洗液、肺泡沖洗液、痰液、肺部組織樣本和支氣管刷檢樣本中的一種或多種。
...【技術特征摘要】
1.一種與肺癌相關的甲基化基因的檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中的甲基化基因，所述試劑盒包括選自以下試劑中的一種或多種：
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，還包括用于內參基因檢測的actb引物和探針。
3.根據權利要求1或2所述的檢測試劑盒，所述待測樣本包含選自人體血液、肺泡灌洗液、肺泡沖洗液、痰液及肺部組織樣本和支氣管刷檢樣本中的一種或多種。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒中包括的組分用于配制pcr反應液，所述pcr反應液包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的檢測試劑盒，其中所述檢測試劑盒包括選自(a...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李丹，江南，劉代新，
申請(專利權)人：蘇州呼呼健康科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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