【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體而言，涉及一種kasp引物組合物、反應體系及在檢測aldh2基因rs671多態性位點中的應用。
技術介紹
1、乙醛脫氫酶縮寫aldh，醛脫氫酶的一種，負責催化乙醛氧化為乙酸的反應，肝中的乙醇脫氫酶負責將乙醇(酒的成分)氧化為乙醛，生成的乙醛作為底物進一步在乙醛脫氫酶催化下轉變為無害的乙酸(即醋的成分)。
2、aldh2基因，全名：acetaldehyde?dehydrogenase?2，乙醛脫氫酶2，位于人類第12號染色體，aldh2同時具有乙醛脫氫酶和酯酶活性，參與乙醇、硝酸甘油等藥物的代謝。aldh2代謝活化硝酸甘油成其活性代謝產物一氧化氮。aldh2*2(glu504lys，rs671)多態性導致所編碼蛋白質504位谷氨酸被賴氨酸所取代，攜帶突變等位基因(aldh2*2)的個體aldh2酶活性下降。aldh2是乙醛在體內分解的關鍵酶。亞洲人群中乙醛脫氫酶2(aldh2*2)的頻率最高。
3、aldh2突變后酶活性缺失，導致乙醛在肝臟內大量累積，使喝酒后會有臉紅等不適反應。aldh2基因型直接影響了乙醛在體內的清除率。aldh2基因正常的人能及時將乙醛最后分解為水和二氧化碳；aldh2基因異常的人，不能快速完成酒精代謝過程，導致乙醛在體內堆積，少量飲酒即出現臉紅、心跳加速等不適，容易對人體的肝、腎、心、腦造成傷害，因此aldh2基因突變者是很多臨床疾病的高危人群。
4、aldh2基因正常(gg)時可以正常代謝乙醛；而該基因完全突變(aa)時則基本喪失代謝乙醛的能力，
5、目前snp分型檢測的主要方法還是taqman探針法和一代測序。taqman探針法快速準確，但是單次合成探針費用昂貴；而一代測序技術作為金標準，但也存在價格昂貴且檢測周期稍長的劣勢。
6、鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種kasp引物組合物、反應體系及在檢測aldh2基因rs671多態性位點中的應用以解決上述技術問題。
2、本專利技術是這樣實現的：
3、第一方面，本專利技術提供了一種檢測aldh2基因rs671多態性位點的kasp引物組合物，其包括：2條正向引物和1條反向引物，其中1條正向引物序列包括：5’-第一標簽序列-(n)n-g-3’，另一條正向引物序列包括：5’-第二標簽序列-(n)n-a，第一標簽序列與第二標簽序列分別與帶有熒光基團的兩對通用探針互補，n選自a、t、c和g中的至少一種，n為15-35，反向引物序列如seq?id?no：3所示。
4、第二方面，本專利技術提供了一種檢測aldh2基因rs671多態性位點的反應體系，其包括上述的kasp引物組合物和擴增反應預混液。
5、第三方面，本專利技術提供了一種試劑盒或基因芯片，其包括上述的kasp引物組合物或上述的反應體系。
6、第四方面，本專利技術提供了kasp引物組合物或上述的反應體系在制備檢測aldh2基因rs671多態性位點的試劑盒或基因芯片中的應用，應用包括如下步驟：將待測樣本與kasp引物組合物混合，進行擴增反應，擴增反應是普通pcr或降落pcr，采集熒光信號，獲得分型結果。
7、本專利技術具有以下有益效果：
8、本專利技術采用近幾年較為流行的kasp(kompetitive?allele-specific?pcr)分型技術，即競爭性等位基因特異性pcr，該方法同taqman探針方法類似，同樣采用雙熒光標記，但kasp技術使用通用探針，位于反應混合液(即反應體系)中，檢測時，只需合成普通擴增引物即可進行檢測。kasp基于終端熒光信號的讀取判斷，每孔反應都是采用雙色熒光檢測一個snp位點的兩種基因型，通過兩對通用探針分別與第一標簽序列和第二標簽序列互補，從而對不同基因型的擴增產物進行熒光基團標記，從而使得不同的snp對應著不同的熒光信號。通過采集分析熒光信號，就可獲得分型結果。
9、本專利技術提供的引物組合物以及試劑盒能實現aldh2基因rs671位點snp準確、快速、簡便檢測，具有靈敏度高、特異性強、操作程序簡單、檢測時間短等優點，具有廣泛的應用前景。
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1.一種檢測ALDH2基因rs671多態性位點的KASP引物組合物，其特征在于，其包括：2條正向引物和1條反向引物，其中1條所述正向引物的序列包括：5’-第一標簽序列-(N)n-G-3’，另一條所述正向引物的序列包括：5’-第二標簽序列-(N)n-A，所述第一標簽序列與所述第二標簽序列分別與帶有熒光基團的兩對通用探針互補，N選自A、T、C和G中的至少一種，n為15-35，所述反向引物的序列如SEQ?ID?NO：3所示。
2.根據權利要求1所述的KASP引物組合物，其特征在于，所述第一標簽序列為GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，所述第二標簽序列為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；
3.一種檢測ALDH2基因rs671多態性位點的反應體系，其特征在于，其包括如權利要求1-2任一項所述的KASP引物組合物和擴增反應預混液。
4.根據權利要求3所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系中2條所述正向引物和1條反向引物的終濃度分別為40-100nM。
5.根據權利要求3所述的反應體系，其特征在于，所述擴增反應預混液包括：DN
6.根據權利要求5所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系還包括2對通用探針，其中一對通用探針的上游序列和下游序列分別如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示，另一對通用探針的上游序列和下游序列分別如SEQ?ID?NO：6和SEQ?ID?NO：7所示；
7.根據權利要求6所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系還包括標準品，所述標準品包括：rs671的GG基因型的質粒、AG基因型的質粒和AA基因型的質粒。
8.根據權利要求7所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系還包括模板DNA。
9.一種試劑盒或基因芯片，其特征在于，其包括權利要求1-2任一項所述的KASP引物組合物或權利要求3-8任一項所述的反應體系。
10.如權利要求1-2任一項所述的KASP引物組合物或權利要求3-8任一項所述的反應體系在制備檢測ALDH2基因rs671多態性位點的試劑盒或基因芯片中的應用，其特征在于，所述應用包括如下步驟：將待測樣本與所述KASP引物組合物混合，進行擴增反應，所述擴增反應是普通PCR或降落PCR，采集熒光信號，獲得分型結果；
...【技術特征摘要】
1.一種檢測aldh2基因rs671多態性位點的kasp引物組合物，其特征在于，其包括：2條正向引物和1條反向引物，其中1條所述正向引物的序列包括：5’-第一標簽序列-(n)n-g-3’，另一條所述正向引物的序列包括：5’-第二標簽序列-(n)n-a，所述第一標簽序列與所述第二標簽序列分別與帶有熒光基團的兩對通用探針互補，n選自a、t、c和g中的至少一種，n為15-35，所述反向引物的序列如seq?id?no：3所示。
2.根據權利要求1所述的kasp引物組合物，其特征在于，所述第一標簽序列為gaaggtgaccaagttcatgct，所述第二標簽序列為gaaggtcggagtcaacggatt；
3.一種檢測aldh2基因rs671多態性位點的反應體系，其特征在于，其包括如權利要求1-2任一項所述的kasp引物組合物和擴增反應預混液。
4.根據權利要求3所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系中2條所述正向引物和1條反向引物的終濃度分別為40-100nm。
5.根據權利要求3所述的反應體系，其特征在于，所述擴增反應預混液包括：dna聚合酶、dntps、mg2...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王保曼，楊明妍，劉波濤，高楠，高方鳴，王鵬云，
申請(專利權)人：生工生物工程上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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