【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子標(biāo)記，涉及一種鑒別椰子椰蛾的方法，更具體為一種利用aflp分子標(biāo)記技術(shù)鑒別椰子椰蛾來源的方法。
技術(shù)介紹
1、椰子椰蛾(agonoxena?sp.)屬椰蛾科(agonoxenidae)椰蛾屬(agonoxena)。
2、aflp分子標(biāo)記技術(shù)，即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，amplified?fragmentlengthpolymorphism是以dna水平為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)鑒別技術(shù)，其具有dna需要量少、檢測(cè)效率高、多態(tài)性高、可靠性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。雖然aflp分子標(biāo)記技術(shù)已在動(dòng)植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有所涉及，但還未見其用于鑒定、追蹤椰子椰蛾的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種鑒別椰子椰蛾的方法，通過使用特異性的引物組合提高了鑒別椰子椰蛾的效率，因而本專利技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)椰子椰蛾的精準(zhǔn)溯源。
2、本專利技術(shù)提供了用于aflp擴(kuò)增反應(yīng)的引物組合，所述引物組合包括：預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物對(duì)和選擇性擴(kuò)增引物對(duì)；
3、所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物對(duì)包括：e00和m00；所述e00的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述m00的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；
4、所述選擇性擴(kuò)增引物對(duì)包括：引物e和引物m組成的引物對(duì)；
5、所述引物e包括：e42、e46、e83、e31、e32、e38、e41、e43、e47或e62；所述引物m包括：m55、m60、m66、m83、m85、m48、m51、m58、m61或m70；所
6、優(yōu)選的，所述選擇性擴(kuò)增引物對(duì)包括：引物e42和引物m55組成的引物對(duì)、引物e46和引物m60組成的引物對(duì)、引物e47和引物m61組成的引物對(duì)、引物e62和引物m66組成的引物對(duì)、引物e83和引物m83組成的引物對(duì)、引物e31和引物m85組成的引物對(duì)、引物e32和引物m48組成的引物對(duì)、引物e38和引物m51組成的引物對(duì)、引物e41和引物m55組成的引物對(duì)、引物e43和引物m58組成的引物對(duì)、引物e46和引物m61組成的引物對(duì)、或引物e62和引物m70組成的引物對(duì)。
7、本專利技術(shù)提供了上述技術(shù)方案所述的引物組合在鑒別椰子椰蛾和/或溯源椰子椰蛾中的應(yīng)用。
8、本專利技術(shù)提供了一種鑒別椰子椰蛾的方法，包括如下步驟：
9、對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行dna提取，得到基因組dna；對(duì)所述基因組dna進(jìn)行aflp擴(kuò)增，得到aflp擴(kuò)增產(chǎn)物；所述aflp擴(kuò)增依次包括酶切-連接反應(yīng)、使用上述技術(shù)方案所述的引物組合進(jìn)行的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擇性擴(kuò)增反應(yīng)；對(duì)所述aflp擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行遺傳多樣性分析和/或親緣關(guān)系分析，鑒別椰子椰蛾的來源。
10、優(yōu)選的，所述酶切-連接反應(yīng)包括：對(duì)基因組dna進(jìn)行ecorⅰ和mseⅰ雙酶切，并在雙酶切產(chǎn)物中加入ecorⅰ接頭和mseⅰ接頭進(jìn)行連接；
11、所述ecorⅰ接頭由ecorⅰ1和ecorⅰ2組成；所述ecorⅰ1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述ecorⅰ2的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；
12、所述mseⅰ接頭的由mseⅰ1和mseⅰ2組成；所述mseⅰ1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述mseⅰ2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
13、優(yōu)選的，所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)以酶切-連接產(chǎn)物為模板dna；
14、所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的體系包括：2×pcr?mix?10μl、20μm的e00?1μl、20μm的e00?1μl、模板dna4μl，加ddh2o至20μl；
15、所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；50℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。
16、優(yōu)選的，所述選擇性擴(kuò)增以預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物為模板dna；
17、所述選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的體系包括：2×pcr?mix?10μl、20μm的引物e1μl、20μm的引物m1μl、模板dna?5μl、加ddh2o至20μl；
18、所述選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性35s，65℃復(fù)性35s，72℃延伸1min，12個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，23個(gè)循環(huán)。
19、有益效果：
20、本專利技術(shù)提供了用于aflp擴(kuò)增反應(yīng)的引物組合，所述引物組合包括預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物和選擇性擴(kuò)增引物；通過使用特異性引物進(jìn)行aflp擴(kuò)增反應(yīng)，增加了aflp分子標(biāo)記的靈敏度。
21、基于上述技術(shù)優(yōu)勢(shì)，本專利技術(shù)還提供了所述的引物組合在鑒別椰子椰蛾和/或溯源椰子椰蛾中的應(yīng)用。通過依次對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行dna提取、aflp擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分析，能夠精對(duì)外來椰子椰蛾進(jìn)行溯源，為防治椰子椰蛾的侵害奠定了科學(xué)的基礎(chǔ)。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于AFLP擴(kuò)增反應(yīng)的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括：預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物對(duì)和選擇性擴(kuò)增引物對(duì)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述選擇性擴(kuò)增引物對(duì)包括：引物E42和引物M55組成的引物對(duì)、引物E46和引物M60組成的引物對(duì)、引物E47和引物M61組成的引物對(duì)、引物E62和引物M66組成的引物對(duì)、引物E83和引物M83組成的引物對(duì)、引物E31和引物M85組成的引物對(duì)、引物E32和引物M48組成的引物對(duì)、引物E38和引物M51組成的引物對(duì)、引物E41和引物M55組成的引物對(duì)、引物E43和引物M58組成的引物對(duì)、引物E46和引物M61組成的引物對(duì)、或引物E62和引物M70組成的引物對(duì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物組合在鑒別椰子椰蛾和/或溯源椰子椰蛾中的應(yīng)用。
4.一種鑒別椰子椰蛾的方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切-連接反應(yīng)包括：對(duì)基因組DNA進(jìn)行EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切，并在雙酶切產(chǎn)物中加入EcoRⅠ接頭和MseⅠ接頭進(jìn)行連接；
6.根據(jù)權(quán)利要求4
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述選擇性擴(kuò)增以預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物為模板DNA；
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于aflp擴(kuò)增反應(yīng)的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括：預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物對(duì)和選擇性擴(kuò)增引物對(duì)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述選擇性擴(kuò)增引物對(duì)包括：引物e42和引物m55組成的引物對(duì)、引物e46和引物m60組成的引物對(duì)、引物e47和引物m61組成的引物對(duì)、引物e62和引物m66組成的引物對(duì)、引物e83和引物m83組成的引物對(duì)、引物e31和引物m85組成的引物對(duì)、引物e32和引物m48組成的引物對(duì)、引物e38和引物m51組成的引物對(duì)、引物e41和引物m55組成的引物對(duì)、引物e43和引物m58組成的引物對(duì)、引物e46和引物m61組成的引物對(duì)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龔治，馬光昌，彭正強(qiáng)，溫海波，唐超，金濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。