【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物化學(xué)，具體涉及一種采用hplc-esi-ms/ms技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法。
技術(shù)介紹
1、草酸是較強(qiáng)極性的小分子酸性物質(zhì)，從技術(shù)角度看尿草酸（uox）的測(cè)定是具有挑戰(zhàn)性的。在國(guó)際上，尿草酸濃度分析技術(shù)也一直是臨床化學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。一種可靠的分析方法是實(shí)施有價(jià)值的尿草酸濃度監(jiān)測(cè)的必要條件。
2、近年來(lái)，報(bào)道了各種檢測(cè)尿草酸的方法，包括酶法、hplc、lc-ms/ms、gc-ms、離子色譜、比色法、熒光法、電化學(xué)方法等。然而，這些方法存在一些缺點(diǎn)，如酶免免疫分析法特異性低，試劑盒昂貴；氣相色譜實(shí)用性差，耗時(shí)長(zhǎng)，需要復(fù)雜的柱前衍生化；而一些其他方法存在需要冗繁的樣品前處理（如需要進(jìn)行酸化）、液液萃取和固相萃取效率低，生物樣品消耗量大（≥100?μl），以及準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。此外，這些方法測(cè)定的尿樣多為24小時(shí)尿樣，不適用于24小時(shí)尿樣采集不方便或困難的患者。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種采用hplc-esi-ms/ms技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法。
2、本專(zhuān)利技術(shù)解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
3、一種采用hplc-esi-ms/ms技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，包括以下步驟：
4、s1、取采集樣本，加入草酸-1，2-13c?作為草酸的內(nèi)標(biāo)，將內(nèi)標(biāo)溶液與采集樣本按照2:1的比例混合，渦旋5?min后，4000?rpm離心5?min，得到尿液樣品；
5、s2、利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行樣品檢
6、液相色譜系統(tǒng)高壓泵a流動(dòng)相：體積百分比為0.01%的氨水-1mm?乙酸銨-超純水溶液；
7、液相色譜系統(tǒng)高壓泵b流動(dòng)相：體積百分比為0.01%的氨水-1mm?乙酸銨-乙腈溶液；
8、色譜條件中，色譜柱為a?waters?symmetry?c18?column，3.5?μm，4.6?mm?×?75mm，柱溫40℃；檢測(cè)模式?mrm，離子源溫度?500℃；流速?0.4?ml/min；梯度洗脫程序?yàn)椋后w積百分比為70%的流動(dòng)相a+體積百分比為30?%的流動(dòng)相b，等度運(yùn)行3?min；進(jìn)樣量為5μl；洗針模式：進(jìn)樣前后洗針液清洗5s；
9、質(zhì)譜條件為：氣簾氣35?psi，噴撞氣?4psi，離子化電壓?4000v，離子源溫度?500℃，噴霧氣?50psi，輔助加熱氣?50psi；
10、s3、采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的草酸-1，2-13c?作為草酸的內(nèi)標(biāo)，通過(guò)制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以草酸工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，讀取結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為y軸，進(jìn)行線性回歸分析，經(jīng)“1/x2”權(quán)重得到回歸方程；將樣品中草酸與其內(nèi)標(biāo)峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算尿液樣品中的草酸濃度。
11、優(yōu)選地，所述步驟s1中質(zhì)譜條件包括草酸及其同位素草酸-1，2-13c的電參條件，具體如下：
12、草酸：母離子?88.9da，子離子?60.8da，掃描時(shí)間?200?msec，去簇電壓?40v，入口電壓?7v，碰撞能量?10v，碰撞室出口電壓?15v；
13、草酸-1，2-13c：母離子?90.8da，子離子?61.8da，掃描時(shí)間?200?msec，去簇電壓14v，入口電壓?2v，碰撞能量?10v，碰撞室出口電壓?4v。
14、優(yōu)選地，所述步驟s2中相關(guān)試劑的組分及其含量為：
15、洗針液：體積百分比為40%的甲醇、體積百分比為40%的乙腈、體積百分比為10%的異丙醇、體積百分比為10%的超純水；
16、內(nèi)標(biāo)溶液：用甲醇溶解草酸-1，2-13c，制備成1.00?mg/ml的內(nèi)標(biāo)原液，再用含體積百分比為0.3%氨水的乙腈稀釋至200?ng/ml；
17、校準(zhǔn)曲線溶液：用甲醇溶解草酸，制備1.00?mg/ml的草酸原液；將甲醇：水按照1:1的體積稀釋原液，分別得到濃度為0.2、0.5、1、5、50、50、100、250和500?μg/ml的草酸工作標(biāo)準(zhǔn)溶液；使用超純水稀釋草酸工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備濃度分別為0.020、0.050、0.100、0.500、10.0、5.0、10.0、25.0、50.0?μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；
18、質(zhì)控溶液qcs：先用甲醇水按照1:1的體積稀釋1.00?mg/ml的草酸原液，分別得到濃度為0.2、1、50、400?μg/ml的草酸質(zhì)控工作標(biāo)準(zhǔn)溶液使用超純水稀釋草酸質(zhì)控工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別得到濃度為0.020、0.100、5、40.0?μg/ml的質(zhì)控樣品；
19、校準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品：將200?μl的沉淀劑分別與100?μl的校準(zhǔn)曲線溶液、質(zhì)控溶液qcs混合，渦旋5?min后，4000?rpm離心5?min，分別得到校準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品。
20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)具有以下有益效果：
21、1.本專(zhuān)利技術(shù)無(wú)需進(jìn)行衍生化、固相萃取、酸化操作，大大簡(jiǎn)化了分析技術(shù)，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高了樣本的穩(wěn)定性；
22、2.本專(zhuān)利技術(shù)能夠檢測(cè)包括但不限于24h的尿樣，在24h尿液樣品收集不便或困難的情況下，通過(guò)本專(zhuān)利技術(shù)的檢測(cè)方法結(jié)合尿肌酐的檢測(cè)數(shù)據(jù)可計(jì)算樣品中的草酸含量，增加了本專(zhuān)利技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景；
23、3.將0.01%nh3?h2o和1mm?nh4ac作為添加劑，有利于草酸進(jìn)行質(zhì)譜電離；
24、4.選擇草酸-1，2-13c為內(nèi)標(biāo)，其具有與分析物完全相同的結(jié)構(gòu)，因此能夠消除基質(zhì)效應(yīng)，使結(jié)果更準(zhǔn)確。
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1.一種采用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，其特征在于，所述步驟S1中質(zhì)譜條件包括草酸及其同位素草酸-1，2-13C的電參條件，具體如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，其特征在于，所述步驟S2中相關(guān)試劑的組分及其含量為：
【技術(shù)特征摘要】
1.一種采用hplc-esi-ms/ms技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用hplc-esi-ms/ms技術(shù)檢測(cè)尿草酸的方法，其特征在于，所述步驟s1中質(zhì)譜...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳峰，王潔，郭宏麗，徐進(jìn)，趙非，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：南京市兒童醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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