【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種大孔瓊脂糖deae色譜凝膠及其制備方法與應(yīng)用，屬于瓊脂糖凝膠微球。
技術(shù)介紹
1、隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，醫(yī)藥、食品和生物工程等領(lǐng)域?qū)ι锎蠓肿臃蛛x和純化技術(shù)提出了更高的要求。色譜技術(shù)作為一種常用的分離純化方法，關(guān)鍵在于色譜填料的性能能夠直接影響分離效率和純化效果。在眾多色譜填料中，瓊脂糖基材料憑借其優(yōu)異的親水性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離和純化。然而，傳統(tǒng)瓊脂糖微球由于孔徑較小、孔隙結(jié)構(gòu)單一且機(jī)械強(qiáng)度低，在高壓條件下難以保持穩(wěn)定性且傳質(zhì)效率低下，嚴(yán)重影響分離純化效率。這些問題在當(dāng)前高效和規(guī)模化的分離需求下顯得尤為突出。
2、為了滿足現(xiàn)代分離純化過程中對(duì)速度和效率的更高要求，解決傳統(tǒng)瓊脂糖微球的局限性，制備具有相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)的瓊脂糖微球成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。在蛋白質(zhì)等大分子的分離中，傳統(tǒng)瓊脂糖微球由于孔徑限制，容易導(dǎo)致分子滯留、傳質(zhì)阻力增加，最終降低了整體分離效果。而大孔結(jié)構(gòu)和豐富的孔隙能夠有效提升微球的傳質(zhì)效率，這是由于較大的孔徑允許大分子更容易進(jìn)入和擴(kuò)散于微球內(nèi)部，還能夠減少分離過程中的擴(kuò)散阻力，從而減少了分子傳遞的時(shí)間，使分離過程更加順暢和快速，滿足快速分離的需求，而豐富的孔隙結(jié)構(gòu)能夠更加充分地分離大分子混合物，提高分離純化效率。此外，大孔結(jié)構(gòu)還改善了微球在高流速操作中的性能。通常在高效色譜系統(tǒng)中，為了加快分離速度會(huì)采用較高的流速操作，而傳統(tǒng)瓊脂糖微球在高流速下常常表現(xiàn)出不穩(wěn)定的流動(dòng)行為，甚至出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，嚴(yán)重影響分離過程的連貫性和可重復(fù)性。而大孔微球由于其開
3、可見，有必要開發(fā)一種具備相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)、孔隙豐富、高機(jī)械強(qiáng)度且具備較強(qiáng)蛋白結(jié)合能力的瓊脂糖基色譜填料，以克服傳統(tǒng)瓊脂糖微球因孔徑較小和孔隙結(jié)構(gòu)單一而導(dǎo)致傳質(zhì)效率低下、在高流速下穩(wěn)定性差，以及在大分子分離純化中結(jié)合容量不足等問題，滿足生物大分子分離與純化過程中的高效需求，提高生物大分子的分離純化效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)提供了一種大孔瓊脂糖deae色譜凝膠及其制備方法與應(yīng)用。本專利技術(shù)采用水溶性蛋白或醇溶性蛋白（優(yōu)選明膠）作為致孔劑（蛋白模板法）并進(jìn)行交聯(lián)改性和功能化修飾，制備得到的大孔瓊脂糖微球具備相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)，孔隙豐富，機(jī)械強(qiáng)度好且傳質(zhì)效率高，分離效率高，流速適應(yīng)性強(qiáng)，可滿足大分子蛋白質(zhì)分離純化的需求，
2、本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
3、一種大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，包括以下步驟：
4、（1）制備復(fù)合微球：將水溶性蛋白或醇溶性蛋白，以及瓊脂糖或葡聚糖溶于水中作為水相，將水相倒入油相中制備得到懸浮液，攪拌冷卻至室溫，離心分離，洗滌，得到瓊脂糖-蛋白復(fù)合微球或葡聚糖-蛋白復(fù)合微球；
5、（2）酶解：采用蛋白酶對(duì)復(fù)合微球進(jìn)行充分酶解，至復(fù)合微球中的蛋白全部被酶解，離心分離，洗滌，得到大孔瓊脂糖微球（ags）或大孔葡聚糖微球；
6、（3）引入交聯(lián)劑：將大孔瓊脂糖微球或大孔葡聚糖微球，與環(huán)氧氯丙烷（ech）進(jìn)行交聯(lián)，以增強(qiáng)大孔瓊脂糖微球或大孔葡聚糖微球的機(jī)械強(qiáng)度，確保其在高壓條件下的穩(wěn)定性，得到交聯(lián)環(huán)氧基的大孔瓊脂糖微球或大孔葡聚糖微球；
7、（4）修飾二乙氨基乙基（deae）基團(tuán)：向交聯(lián)環(huán)氧基的大孔瓊脂糖微球或大孔葡聚糖微球中引入deae基團(tuán)，使大孔瓊脂糖微球或大孔葡聚糖微球具備陰離子交換功能，提高其蛋白質(zhì)結(jié)合能力和選擇性，得到大孔瓊脂糖deae色譜凝膠或大孔葡聚糖deae色譜凝膠。
8、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中，水溶性蛋白選自明膠，瓊脂糖與明膠的重量比為3:（1～10），優(yōu)選3:4、3:7；醇溶性蛋白選自玉米醇溶蛋白。
9、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中，油相為液體石蠟。
10、進(jìn)一步地，所述步驟（1）的具體方法如下：
11、（a）將3?g瓊脂糖粉末分散在50?ml水中，加熱使其完全溶解，得到澄清透明的瓊脂糖溶液；將1～10?g明膠顆粒分散在50?ml水中，加熱使其完全溶解，得到澄清透明的明膠溶液；
12、（b）將上述瓊脂糖溶液與明膠溶液混合，得到瓊脂糖-明膠溶液作為水相，其中，瓊脂糖的質(zhì)量濃度為3%，明膠的質(zhì)量濃度為1%～10%；
13、（c）將上述瓊脂糖-明膠溶液倒入400?ml液體石蠟（事先加熱至80℃）中，加入16?g的span?80作為乳化劑，攪拌至充分混合，得到懸浮液；
14、（d）上述懸浮液進(jìn)行乳化，然后在攪拌條件下冷卻至室溫，離心分離，收集微球，依次用石油醚、異丙醇、超純水進(jìn)行清洗，得到瓊脂糖-明膠復(fù)合微球。
15、進(jìn)一步地，所述步驟（2）的具體方法如下：將瓊脂糖-明膠復(fù)合微球加入蛋白酶溶液（質(zhì)量濃度為15%～20%）中，50℃酶解72?h，充分去除復(fù)合微球中的明膠；酶解后，離心分離，收集微球，超純水充分洗滌，得到大孔瓊脂糖微球。
16、進(jìn)一步地，所述步驟（3）的具體方法如下：將5?g的ags、70?ml的ech、75?ml二甲基亞砜、110?mg硼氫化鈉和150?ml的naoh溶液混合，40℃下攪拌反應(yīng)12?h；超純水充分洗滌，得到交聯(lián)環(huán)氧基的大孔瓊脂糖微球。
17、進(jìn)一步地，所述步驟（4）的具體方法如下：將5?g的ags-ech分散在10?ml的deae-hcl溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)30?min；超純水充分洗滌，得到大孔瓊脂糖deae色譜凝膠。
18、利用上述方法制備得到的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠，具有大孔徑、高機(jī)械強(qiáng)度以及優(yōu)異的蛋白結(jié)合能力。
19、所述大孔瓊脂糖deae色譜凝膠作為色譜填料在生物大分子的分離或/和純化中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，所述生物大分子為蛋白質(zhì)，優(yōu)選分子量為11～245?kda的蛋白質(zhì)。
20、本專利技術(shù)的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，首先以水溶性蛋白或醇溶性蛋白（優(yōu)選明膠）作為致孔劑，制備了具有均勻球形結(jié)構(gòu)和高度發(fā)達(dá)孔隙的大孔瓊脂糖微球，然后將環(huán)氧交聯(lián)劑與大孔瓊脂糖微球結(jié)合，制備成具有高機(jī)械強(qiáng)度的大孔瓊脂糖微球，然后將deae基團(tuán)引入交聯(lián)后的微球，制備出適用于高效分離與純化的親和色譜填料。該大孔瓊脂糖親和色譜凝膠，具備高度發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)和顯著增大的孔徑，具有高機(jī)械強(qiáng)度和較強(qiáng)的蛋白結(jié)合能力，具有高傳質(zhì)效率、高壓穩(wěn)定性和優(yōu)異的選擇性，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在微球內(nèi)部的快速傳質(zhì)，大幅提升分離純化的效率，有效克服傳統(tǒng)瓊脂糖微球由于孔徑限制而容易導(dǎo)致分子滯留、傳質(zhì)阻力增加的劣本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中，水溶性蛋白選自明膠，瓊脂糖與明膠的重量比為3:（1～10）；醇溶性蛋白選自玉米醇溶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中，油相為液體石蠟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）的具體方法如下：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）的具體方法如下：將瓊脂糖-明膠復(fù)合微球加入蛋白酶溶液中，50℃酶解72?h，充分去除復(fù)合微球中的明膠；酶解后，離心分離，收集微球，超純水充分洗滌，得到大孔瓊脂糖微球。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）的具體方法如下：將5?g的AGs、70?mL的ECH、75?mL二甲基亞砜、110?mg硼氫化鈉和150mL的
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）的具體方法如下：將5?g的AGs-ECH分散在10?mL的DEAE-HCl溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)30min；超純水充分洗滌，得到大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠。
8.利用權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠。
9.權(quán)利要求8所述的大孔瓊脂糖DEAE色譜凝膠在生物大分子的分離或/和純化中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述生物大分子為蛋白質(zhì)。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中，水溶性蛋白選自明膠，瓊脂糖與明膠的重量比為3:（1～10）；醇溶性蛋白選自玉米醇溶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中，油相為液體石蠟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）的具體方法如下：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大孔瓊脂糖deae色譜凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）的具體方法如下：將瓊脂糖-明膠復(fù)合微球加入蛋白酶溶液中，50℃酶解72?h，充分去除復(fù)合微球中的明膠；酶解后，離心分離，收集微球，超純水充分洗滌，得到大孔瓊脂糖微球。
6.根據(jù)權(quán)利要...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛長(zhǎng)湖，鄭洪偉，李雨倩，楊魯，魏發(fā)奕，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)海洋大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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