【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因、篩選方法、引物和應用，屬于分子生物學。
技術介紹
1、家蠶(bombyx?mori)作為一種完全變態發育的昆蟲，因其具有吐絲能力而被馴養，用于蠶絲生產。家蠶飼養周期較短且成本相對較低，具有重要的經濟價值；其獨特的遺傳學背景、完整的發育過程以及廣泛的應用潛力，使得家蠶不僅作為一種傳統的經濟昆蟲，還作為模式生物在現代科學研究中具有重要的地位，在昆蟲學、發育生物學、基因組學以及生物技術等研究領域發揮了重要作用。家蠶生命周期包括四個主要階段：卵、幼蟲(蠶)、蛹和成蟲(蛾)，其中幼蟲階段又可以分為一齡、二齡、三齡、四齡和五齡，家蠶的各發育階段由特定基因表達決定了不同器官的發育與形態變化，家蠶的變態發育過程的研究不僅對養蠶業至關重要，也是研究昆蟲生長發育與代謝調控的經典模型。
2、家蠶作為模式動物，研究人員經常需要利用實時熒光定量pcr(qpcr)技術檢測功能基因的表達情況；內參基因是用來矯正實驗過程中不同發育階段的家蠶樣品間的差異，因此內參基因的選擇會直接影響qpcr結果的準確性和可信度。因此篩選一個在家蠶發育的不同階段表達穩定性高、且不受變態發育過程的影響的內參基因至關重要。
3、轉錄組測序(rna-seq)是研究細胞或組織在特定時間和條件下全部轉錄產物的一項技術，能夠對生物體內的轉錄本進行全面分析從而揭示基因調控機制，具有通量和靈敏度高、定量準確和適用樣本范圍廣等優點。因此通過轉錄組學技術，可以系統的比較家蠶在不同發育階段下的基因表達情況，識別出在不同發育
技術實現思路
1、針對以上當前存在的一些技術問題，本專利技術提供了一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因、篩選方法、引物和應用。
2、本專利技術采用轉錄組學技術，對處于不同發育階段的家蠶樣品測序，篩選出家蠶全生命周期穩定表達的基因cyclophilin?a(cypa)，提供cypa基因和引物序列，并作為內參基因應用于qpcr實驗中。本專利技術所提供內參基因的引物序列，可同時應用于家蠶所有發育階段，具有靈敏度高，表達量穩定，適用樣品類型范圍廣的特點，提升了qpcr結果的準確性和可信度。
3、為達到上述技術目的，本專利技術提供如下技術方案：
4、本專利技術首先提供一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因，所述內參基因為cyclophilin?a(cypa)基因，其核苷酸序列如seq?id?no：1所示。
5、其中，所述家蠶全發育階段包括：卵、幼蟲、蛹和成蟲(蛾)，其中幼蟲階段包括一齡、二齡、三齡、四齡和五齡。
6、進一步的，所述內參基因的引物序列如seq?id?no：2和seq?id?no：3所示。
7、本專利技術還提供一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的引物，所述引物的核苷酸序列如seq?id?no：2和seq?id?no：3所示。
8、本專利技術還提供一種家蠶全發育階段基因表達分析試劑盒，所述試劑盒包括所述的引物。
9、本專利技術還提供所述內參基因、引物、或所述試劑盒在家蠶全發育階段基因表達分析中的應用。
10、本專利技術還提供所述內參基因的篩選方法，所述方法包括：
11、(1)根據家蠶不同發育階段的轉錄組數據，篩選候選內參基因，并設計qpcr引物。
12、其中，轉錄組數據包括：發育階段表達量穩定、無顯著差異(p>0.05)、表達量大于190和變異系數小。
13、(2)采取不同發育階段家蠶樣本，提取rna并反轉錄cdna，以得到的cdna為模版，步驟(1)引物分別對候選內參候選基因進行qpcr實驗，得到每個候選內參基因在家蠶不同發育階段的cq值。
14、(3)對候選內參基因在家蠶不同發育階段的穩定性進行評價；
15、優選的，使用comprehensive?ranking、delta?ct、bestkeeper和normfinder四種在線工具對候選內參基因的在家蠶不同發育階段的穩定性進行評價。
16、(4)結合候選內參基因表達量、穩定性和參考內參基因進行比較，最終篩選出適用于家蠶全發育階段的內參基因。
17、其中，所述參考內參基因為actina3基因。
18、需要有內參基因通過與等量待測樣本中的目的基因的cq值進行比較，通過2^-δδcq公式計算，可獲得待測樣本的相對表達量。通過內參基因矯正后，可以消除上樣量和上樣過程中存的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。
19、與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：
20、(1)本專利技術采用轉錄組學技術，篩選出一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因cypa，使得在對家蠶功能基因進行檢測時，彌補了通過經驗選擇內參基因的不足，提高了qpcr結果的準確性和可信度。
21、(2)本專利技術通過轉錄組學技術篩選候選內參基因，進一步優化了通過轉錄組學技術篩選內參基因的流程和評價指標，首先確定在家蠶全發育階段穩定表達且變異系數最小的內參基因，再通過comprehensive?ranking、delta?ct、bestkeeper和normfinder對內參基因穩定性進行綜合評價，最終確定可以最大程度減少由于家蠶變態發育過程中導致的偏差的內參基因cypa。
22、(3)本專利技術還提供了檢測cypa內參基因的引物，所述引物具有良好的種屬特異性，對家蠶全發育階段檢測過程中經常接觸的人類基因組沒有擴增反應，可很好的應用于內參基因cypa的檢測和擴增。
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1.一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因，其特征在于，所述內參基因為Cyclophilin?A(CYPA)基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。
2.根據權利要求1所述的內參基因，其特征在于，所述家蠶全發育階段包括：卵、幼蟲、蛹和成蟲，其中幼蟲階段包括一齡、二齡、三齡、四齡和五齡。
3.根據權利要求1所述的內參基因，其特征在于，所述內參基因的引物序列如SEQIDNo：2和SEQ?ID?No：3所示。
4.用于家蠶全發育階段的內參基因基因表達分析的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ?ID?No：2和SEQ?ID?No：3所示。
5.一種家蠶全發育階段基因表達分析試劑盒，所述試劑盒包含權利要求4所述的引物。
6.權利要求1-3任一項所述內參基因、權利要求4所述引物、或權利要求5所述試劑盒在家蠶全發育階段基因表達分析中的應用。
7.權利要求1-3任一項所述內參基因的篩選方法，其特征在于，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中所述轉錄組數據包括發育
9.根據權利要求7所述的篩選方法，其特征在于，使用Comprehensive?ranking、deltaCT、BestKeeper和Normfinder四種在線工具對候選內參基因的在家蠶不同發育階段的穩定性進行評價。
10.根據權利要求7所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)中所述參考內參基因為ActinA3基因。
...【技術特征摘要】
1.一種用于家蠶全發育階段基因表達分析的內參基因，其特征在于，所述內參基因為cyclophilin?a(cypa)基因，其核苷酸序列如seq?id?no：1所示。
2.根據權利要求1所述的內參基因，其特征在于，所述家蠶全發育階段包括：卵、幼蟲、蛹和成蟲，其中幼蟲階段包括一齡、二齡、三齡、四齡和五齡。
3.根據權利要求1所述的內參基因，其特征在于，所述內參基因的引物序列如seqidno：2和seq?id?no：3所示。
4.用于家蠶全發育階段的內參基因基因表達分析的引物，其特征在于，所述引物序列如seq?id?no：2和seq?id?no：3所示。
5.一種家蠶全發育階段基因表達分析試劑盒，所述試劑盒包含權利要求4所述的引物。
6.權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫琳丹，孫彬彬，徐競琦，金旭晟，陳克平，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：
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