【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物發酵，具體涉及一種重組a型人源化iii型膠原蛋白菌株的發酵方法。
技術介紹
1、膠原蛋白是動物結締組織中的主要成分，其常見類型為ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和?型。人體皮膚中的膠原蛋白主要以i型與ⅲ型為主，天然膠原蛋白一般由三條單鏈組成，每一條單鏈的分子量一般120kda左右，其氨基酸組成特點為gly-x-y(x、y代表氨基酸，其中y多為脯氨酸)，而且還存在一定比例的羥脯氨酸。羥脯氨酸對維持膠原蛋白的三股螺旋結構以及生物特性有著重要的作用。
2、目前，膠原蛋白獲取方法主要由2種途徑，一種是動物組織提取，該方法得到的膠原蛋白一般是混合物，不穩定性，一般有交叉污染的危險，免疫原性強，影響了膠原蛋白在醫藥方面的應用。另一種是通過重組菌株發酵的方式獲取。
3、隨著合成生物學的出現與迅速發展，基因重組表達的方法越來越受歡迎，各種細胞宿主被用來表達外源蛋白。中國專利202410768271.5，公開了一種重組a型人源化iii型膠原蛋白及其表達工程菌，但未涉及發酵方法。中國專利201110327865.5利用巴氏畢赤酵母基因工程菌表達膠原蛋白，經發酵培養得到重組人源膠原蛋白，但在發酵末期，膠原蛋白存在嚴重的降解，導致發酵水平低，不利于工業生產。因此，在發酵末期，穩定產物不被蛋白酶降解，至關重要。中國專利201810049618.5，在甲醇誘導84h后，向發酵罐中一次性添加0.2～0.5m?l-賴氨酸或l-精氨酸，以提高重組人源膠原蛋白穩定性。畢赤酵母發酵手冊上提到，加入水解絡蛋白胨能有效減少膠原蛋白的降解，
4、因此，本領域亟需一種減少膠原蛋白降解的重組菌發酵方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種重組膠原蛋白菌株的發酵方法，本專利技術提供的方法不僅能夠使重組菌株表達大量的膠原蛋白，還可以減少膠原蛋白在發酵過程中的降解。
2、為了實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、本專利技術提供了一種重組膠原蛋白菌株的發酵方法，所述方法包括：
4、將菌株接種到發酵培養基中進行培養，甘油消耗完后流加甘油，菌體濕重為180-220g/l時停止流加甘油，之后加入檸檬酸銨和牛骨蛋白胨，然后流加甲醇直至發酵結束；所述流加甘油的量為控制培養基中甘油濃度為1.8％-2％；所述流加甲醇的量為控制培養基中甲醇濃度為0.8％-1％。
5、優選地，所述菌株為畢赤酵母。
6、優選地，所述發酵培養基的配方為：每30l發酵培養基中，包括8.3g硫酸鈣，182g硫酸鉀，72.8g七水硫酸鎂，41.3g氫氧化鉀，400g甘油，267ml濃磷酸，10ml消泡劑。
7、優選地，所述檸檬酸銨和牛骨蛋白胨的加入方式為一次性加入，加入量為檸檬酸銨總量為10g/l、牛骨蛋白胨總量為20g/l。
8、優選地，菌株接種到發酵培養基中的接種量為5～12％。
9、優選地，所述發酵方法中，培養過程中的發酵溫度為25～30℃。
10、優選地，所述發酵方法中，培養過程中的ph為4.5～5.4，用氨水調節。
11、優選地，所述發酵方法中，培養過程中培養基的溶氧不低于20％。
12、優選地，流加甲醇的時間為90～120小時。
13、有益效果：
14、本專利技術的發酵方法能有效防止目的產物被蛋白酶降解。本專利技術在發酵過程中，經過甘油流加后，一次性加入檸檬酸銨和牛骨蛋白胨后再進行甲醇流加誘導表達階段直至發酵結束，使得大罐發酵產物重組人源膠原蛋白穩定保留95％以上并且表達量提升20％左右，明顯降低了生產成本，減少企業人力、物力的損失，穩定供貨，為企業產生巨大的經濟價值。
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1.一種重組膠原蛋白菌株的發酵方法，其特征在于，所述方法包括：將菌株接種到發酵培養基中進行培養，甘油消耗完后流加甘油，菌體濕重為180-220g/L時停止流加甘油，之后加入檸檬酸銨和牛骨蛋白胨，然后流加甲醇直至發酵結束；所述流加甘油的量為控制培養基中甘油濃度為1.8％-2％；所述流加甲醇的量為控制培養基中甲醇濃度為0.8％-1％。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株為畢赤酵母。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為：每30L發酵培養基中，包括8.3g硫酸鈣，182g硫酸鉀，72.8g七水硫酸鎂，41.3g氫氧化鉀，400g甘油，267ml濃磷酸，10ml消泡劑。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檸檬酸銨和牛骨蛋白胨的加入方式為一次性加入，加入量為：檸檬酸銨總量為10g/L、牛骨蛋白胨總量為20g/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株接種到發酵培養基中的接種量為5～12％。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵方法中，培養過程中的發
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵方法中，培養過程中的pH為4.5～5.4，用氨水調節。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵方法中，培養過程中培養基的溶氧不低于20％。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，流加甲醇的時間為90～120小時。
...【技術特征摘要】
1.一種重組膠原蛋白菌株的發酵方法，其特征在于，所述方法包括：將菌株接種到發酵培養基中進行培養，甘油消耗完后流加甘油，菌體濕重為180-220g/l時停止流加甘油，之后加入檸檬酸銨和牛骨蛋白胨，然后流加甲醇直至發酵結束；所述流加甘油的量為控制培養基中甘油濃度為1.8％-2％；所述流加甲醇的量為控制培養基中甲醇濃度為0.8％-1％。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株為畢赤酵母。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為：每30l發酵培養基中，包括8.3g硫酸鈣，182g硫酸鉀，72.8g七水硫酸鎂，41.3g氫氧化鉀，400g甘油，267ml濃磷酸，10ml消泡劑。
4.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡靜波，殷利紅，曾輝云，陳浩，王輝，朱洲全，
申請(專利權)人：浙江暨北生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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