【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種高活性重組人tgf-β1制備方法。
技術介紹
1、轉化生長因子β1（transforming?growth?factor?beta?1，tgf-β1）是一種多功能細胞因子，屬于轉化生長因子超家族，包括三種不同的哺乳動物亞型，tgf-β1，β2，β3和許多其他信號蛋白。tgf-β蛋白可以由多種白細胞產生，包括巨噬細胞，它可以調節腸道的炎癥反應，并且在干細胞分化中發揮著至關重要的作用。tgf-β1可以促進t-helper?17?cells（th17）細胞和regulatory?t-cells?(treg)細胞的增殖。tgf-β1可以促進嚙齒類成纖維細胞增殖。可以抑制細胞停留在g1期，可以控制細胞凋亡，促進成纖維化。
2、tgf-β蛋白合成后，tgf-β的同源二聚體和一個lap相互作用形成小的復合物稱為small?latent?complex（slc）。slc復合物在細胞內，與ltbp（latent?tgf-β-bindingprotein）蛋白結合后形成大的復合物稱為large?latent?complex（llc）。llc能分泌到細胞基質中。整合素（integrin）能結合lap的領結狀尾部導致lap多肽鏈彎曲，釋放出tgf-β1。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的技術問題，本專利技術提供了以下的技術方案。
2、一種高活性重組人tgf-β1蛋白的制備方法，所述制備方法步驟為：
3、1）將hek293無血清基
4、2）將步驟1）中的混合溶液添加到預混裝的轉染溶液中，所述預混裝的轉染溶液的組分為hek293無血清基礎培養基和ta-293轉染試劑（珠海愷瑞，k20001），所述hek293無血清基礎培養基和ta-293轉染試劑的比例為25ml：5ml，得質粒-載體復合物；
5、3）質粒-載體復合物室溫靜置10分鐘；
6、4）取轉染備用的細胞，邊搖邊加入制備好的質粒-載體復合物完成轉染，將轉染后的細胞放回細胞培養恒溫搖床中震蕩培養，以當天為day0；
7、5）轉染day1加入初始體積0.6%?ke-293（珠海愷瑞，k30001），和5%補料培養基（同立海源，as-18）（即：1l細胞培養液中添加6ml?ke-293和50ml補料培養基）；
8、6）轉染day3加入初始體積5%補料培養基；
9、7）day5時10000rpm離心10min，收獲細胞料液；
10、8）步驟7）中細胞料液通過ni純化步驟，具體使用5?ml?ni-nta?purose?6?fastflow，以4%、10%、50%的比例進行平衡-上樣-平衡-洗脫過程，平衡液組分為50mm?tris?0.1mnacl?ph8.0，洗脫液組分為50mm?tris?0.1m?nacl?0.5m咪唑?ph8.0；
11、9）步驟8）的產物進一步進行陽離子層析精純，具體使用5?ml?sp?sepharosetmfast?flow，用注射水調節至cond：4.8ms/cm，用6m?hcl調節至ph4.5，進行平衡-上樣-平衡-階梯洗脫的過程，其中，平衡液組分為20mm?naac，150mm?nacl，20mm?醋酸銨，0.5m?尿素1%冰醋酸，ph4.5；洗脫液組分為20mm?naac，1m?nacl，0.5m?尿素，1%冰醋酸，ph4.5，得到純化的高活性重組人tgf-β1蛋白。
12、進一步，在細胞瞬時轉染前需確定其細胞密度及存活率。
13、進一步，使用生長處于指數期，細胞密度約為2~4×106個/ml、存活率大于95%的細胞轉染。
14、進一步，所述細胞無需離心。
15、進一步，所述細胞密度為3.0×106個/ml時，直接轉染。
16、進一步，所述細胞密度>3.0×106個/ml，兌入hek293無血清基礎培養基，將細胞密度稀釋成3×106個/ml，再進行轉染。
17、進一步，所述細胞在5%的co2恒溫搖床中，37℃、120rpm恒溫震蕩培養，轉染備用。
18、進一步，所述day1、day3時取1ml細胞懸液計數，記錄細胞密度和活率并離心留上清。
19、進一步，在day4時取1ml細胞懸液計數，記錄細胞密度和活率并離心留上清。
20、進一步，所述初始體積0.6%?ke-293為6ml?ke-293。
21、進一步，所述5%補料培養基補充體積為50ml。
22、在一些實施方案中，所述制備方法中hek293無血清基礎培養基、ta-293轉染試劑、ke-293出自珠海愷瑞的hek-293瞬轉表達套裝。
23、本專利技術提供了一種高純度高活性重組人tgf-β1蛋白，所述重組人tgf-β1蛋白通過前面所述的制備方法制備得到。
24、本專利技術提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼seq?id?no:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
25、本專利技術提供了一種載體，所述載體包括前面所述的多核苷酸。
26、進一步，所述載體包括質粒載體、病毒載體。
27、進一步，所述病毒載體包括慢病毒載體、流感病毒載體、肝炎病毒載體、甲病毒載體、絲狀病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體和/或黃病毒載體。
28、進一步，所述腺相關病毒載體包括ssaav、scaav和/或雜交aav亞型。
29、進一步，所述腺相關病毒載體包括aav1，aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13。
30、進一步，所述載體為質粒載體。
31、在一些實施方案中，本專利技術使用的載體所具備的運載核酸分子的功能是公眾熟知的，其轉運核酸分子所需技術、方法與材料均可在相應領域技術文件中公開獲得，所述技術包括但不限于載體構建、載體與目的基因的連接、載體的轉運以及轉運后的細胞培養等。
32、在一些實施方案中，所述載體還可包含有其他適當的“調控元件”或“調控序列”，其包括但不限于增強子；轉錄因子；轉錄終止子；高效rna處理信號，如剪接和聚腺苷酸化信號(polya)；穩定胞質mrna的序列，如土拔鼠肝炎病毒(whv)轉錄后調控元件(wpre)；增強翻譯效率的序列(即，kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；和在需要時，增強所編碼產物的分泌的序列。在某些實施方案中，所述polya的實例包括sv40、牛生長激素(bgh)和tkpolya。在某些實施方案中，所述增強子的實例包括α胎蛋白增強子、ttr最小啟動子/增強子、lsp(th結合球蛋白啟動子/α1-微球蛋白/比庫蛋白(bikunin)增強子)以及其它增強子。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高活性重組人TGF-β1蛋白的制備方法，所述制備方法步驟為：
2.如權利要求1所述的制備方法，在細胞瞬時轉染前需確定其細胞密度及存活率；
3.如權利要求1所述的制備方法，所述細胞無需離心；
4.如權利要求1所述的制備方法，所述細胞在5%的CO2恒溫搖床中，37℃、120rpm恒溫震蕩培養，轉染備用。
5.如權利要求1所述的制備方法，所述Day1、Day3時取1ml細胞懸液計數，記錄細胞密度和活率并離心留上清；
6.一種高純度高活性重組人TGF-β1蛋白，所述重組人TGF-β1蛋白通過權利要求1-5任一項所述的制備方法制備得到。
7.一種多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.一種載體，所述載體包括權利要求7所述的多核苷酸；
9.一種細胞，所述細胞包括權利要求8所述的載體；
10.權利要求1-5任一項所述的制備方法、權利要求7所述的多核苷酸、權利要求8所述的載體、權利要求9所述的細胞在制備高純度高活性重組人TGF-β1蛋
...【技術特征摘要】
1.一種高活性重組人tgf-β1蛋白的制備方法，所述制備方法步驟為：
2.如權利要求1所述的制備方法，在細胞瞬時轉染前需確定其細胞密度及存活率；
3.如權利要求1所述的制備方法，所述細胞無需離心；
4.如權利要求1所述的制備方法，所述細胞在5%的co2恒溫搖床中，37℃、120rpm恒溫震蕩培養，轉染備用。
5.如權利要求1所述的制備方法，所述day1、day3時取1ml細胞懸液計數，記錄細胞密度和活率并離心留上清；
6.一種高純度高活性重...
【專利技術屬性】
技術研發人員：霍景瑞，胡穎嵩，喬倩，王立燕，
申請(專利權)人：北京同立海源生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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