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    用于DNA堿基編輯的方法和組合物技術
    
                            
    技術編號：44338952 閱讀：5 留言：0更新日期：2025-02-18 20:50
    
                        
    
                        
    
                            
                            本發明專利技術涉及用于修飾細胞的基因組中的靶位點的方法和組合物。提供了融合蛋白，這些融合蛋白包括通過改進的接頭序列連接的一種或多種DNA結合結構域和一種或多種異源結構域，如DNA修飾結構域。提供了密碼子優化的多核苷酸，這些多核苷酸編碼包括通過改進的接頭序列連接的一種或多種DNA結合結構域和一種或多種異源結構域的融合蛋白。
    
                            
                            
    


    
                            

                            
    【技術實現步驟摘要】
    
                                
    本專利技術涉及用于在細胞的基因組中靶向核苷酸堿基編輯的方法和組合物。關于序列表的電子提交的聲明特此附上并存檔ascii文本格式的序列表，該序列表是根據37c.f.r.§1.821提交的，標題為“81945_st25”，創建于2020年9月18日，大約702千字節，并且通過引用并入本文。

    技術介紹
    1、農業上非常需要具有編輯植物基因組的能力，以便創造有利的等位基因。有可能增加產量或預防疾病。基因組編輯是新領域，其中植物方面的進展滯后。此外，除了預期的變化外，基因組的變化是限制實現所期望的變化所面臨的一個問題。crispr-cas9通過對dna進行雙鏈切割起作用。由于這種斷裂通過非同源末端連接或同源依賴性修復來進行修復，因此可能發生dna堿基插入或缺失。稱為堿基編輯的策略可以對dna進行改變，而不需要切割以及產生插入和缺失。在一個版本中，稱為胞苷脫氨酶的酶通過cas9(shimatani等人,2017.nat.biotechnol.[自然生物技術]35,441-443)或cas12a(li等人,2018.nat.biotechnol.[自然生物技術]36,324-327)酶靶向特定堿基，將cas9或cas12a酶進行修飾以使其不能切割dna。胞苷脫氨酶和核酸酶缺陷型cas9或cas12a通過氨基酸接頭的連接而融合在一起。接頭連接的改進可以改進融合蛋白的功能性，如通過減少靶標堿基的改變來改進切割的精確度。

    技術實現思路
    1、為了滿足這種改進需要，我們提供了優化的和改進的cas12a酶和構建體。特別地，我們提供了包含異源結構域、第一接頭序列以及v型crispr-cas酶的融合蛋白。第一接頭序列包含重復的ggggs序列。異源結構域可以為脫氨酶、聚合酶、核酸酶、松弛酶、烷基轉移酶、甲基轉移酶、腺苷脫氨酶、胞苷脫氨酶、氧化酶、胸腺嘧啶烷基轉移酶、腺嘌呤氧化酶、腺苷甲基轉移酶、糖基化酶或核定位信號。用于堿基編輯，異源結構域為脫氨酶結構域—如胞苷脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶。胞苷脫氨酶結構域可以是激活誘導的胞苷脫氨酶(“aid”)或載脂蛋白b?mrna-編輯復合物(“apobec”)結構域，如來自脫氨酶的apobec1家族。在一些背景下，apobec結構域包含與seq?id?no:1具有至少70％同一性的序列。當需要腺嘌呤脫氨酶時，腺嘌呤脫氨酶可以是tada結構域，該結構域包含與seq?id?no:92具有至少70％同一性的氨基酸序列。
    2、當v型crispr-cas酶為v型-a(“cas12a”)酶時，cas12a選自由以下組成的組：seqid?no:3、seq?id?no:6、seq?id?no:22、seq?id?no:45、seq?id?no:46、seq?id?no:47以及seq?id?no:48。cas12a結構域可以是無催化活性的，但仍與靶dna結合，并且允許異源結構域起作用。當cas12a無活性，其序列為seq?id?no:3、seq?id?no:6或seq?id?no:22。
    3、異源結構域和cas12a酶之間的第一接頭序列可以包含重復至少三次的ggggs。在其他用途中，第一接頭序列可以包含重復至少六次的ggggs。
    4、融合蛋白可以包含seq?id?no:11、12、13或44，并且其還可以包括尿嘧啶dna糖基化酶抑制劑(“ugi”)結構域(如seq?id?no:8表示)。ugi結構域可以通過包含序列sggs的第二接頭與cas12a酶連接。融合蛋白可以包含seq?id?no:17、seq?id?no:24、seq?id?no:35、seq?id?no:39、seq?id?no:43、seq?id?no:50、seq?id?no:52、seq?id?no:54、seq?id?no:56、seq?id?no:81、seq?id?no:83、seq?id?no:85、seq?id?no:87或seq?id?no:89。當與dna接觸時，與缺少重復的ggggs序列的第一接頭序列的現有技術融合蛋白相比，這些融合蛋白以增加的頻率產生靶上編輯，并且以降低的頻率產生脫靶編輯。
    5、我們還提供了編輯植物基因組dna的方法，該方法通過將植物基因組dna與以下接觸：(a)如通過以上方面之一所述的融合蛋白，并且該融合蛋白任選地包含ugi結構域；以及(b)將步驟(a)的融合蛋白靶向至植物基因組dna的靶dna序列的指導rna(“grna”)；其中與通過具有除重復的ggggs序列外的第一接頭的融合蛋白編輯的植物基因組dna相比，經編輯的植物基因組dna包含減少的脫靶編輯。
    6、我們還提供了編輯具有減少的脫靶編輯的植物基因組dna的方法，該方法通過將植物基因組dna與以下接觸：(a)如通過以上方面之一所述的融合蛋白，并且該融合蛋白任選地包含ugi結構域；以及(b)將步驟(a)的融合蛋白靶向至植物基因組dna的靶dna序列的指導rna(“grna”)；其中與通過具有除重復的ggggs序列外的第一接頭的融合蛋白編輯的植物基因組dna相比，經編輯的植物基因組dna包含減少的脫靶編輯。在一方面，融合蛋白包含seq?id?no:24。
    7、我們還提供了通過以下來獲得具有減少的脫靶編輯的經編輯的植物群體的方法：(a)獲得包含待編輯的基因組dna的植物細胞的群體；(b)獲得編碼如通過以上方面之一所述的融合蛋白、和任選地ugi結構域的核苷酸序列；(c)用步驟(b)的核苷酸序列轉化植物細胞的群體，從而表達通過植物細胞的群體內的核酸序列編碼的融合蛋白；(d)使轉化的植物細胞的群體生長成植物，其中至少一種植物被編輯；以及(e)從步驟(d)的產物中選擇至少一種經編輯的植物，從而獲得經編輯的植物群體；其中與通過具有除重復的ggggs序列外的第一接頭的融合蛋白編輯的植物相比，經編輯的植物群體包含減少的脫靶編輯。在一方面，編碼融合蛋白的核苷酸序列包含seq?id?no:17、seq?id?no:24、seq?id?no:35、seq?id?no:39、seq?id?no:43、seq?id?no:50、seq?id?no:52、seq?id?no:54、seq?id?no:56、seq?idno:81、seq?id?no:83、seq?id?no:85、seq?id?no:87或seq?id?no:89。
    本文檔來自技高網...
                            
    
                            
    【技術保護點】
    
                                
    1.一種融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ?ID?NO:17組成。
    
                            
    
                            
    【技術特征摘要】
    
                                
    1.一種融合蛋白，其中所述融合蛋白...
                            
    
                            
    【專利技術屬性】
    
                                技術研發人員：許建平，李江，
    
        申請(專利權)人：先正達農作物保護股份公司，
    
        類型：發明
    
        國別省市：
    
                            
    
                            
                        
    
                    
    
                    
                    
                     
                
    
                
                
    
                    
    
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