【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及永生化細(xì)胞，尤其涉及一種單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系、制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、中國統(tǒng)計年鑒顯示，2012至2022年的十年間，中國羊肉產(chǎn)量由404.5萬噸穩(wěn)步增長至524.5萬噸。隨著生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，消費者對羊肉的需求增加，對羊肉的品質(zhì)也提出了更高的要求。肌內(nèi)脂肪（intramuscular，fat，imf）也稱為大理石紋脂肪，其含量與山羊肉的嫩度，風(fēng)味和多汁性等影響肉類品質(zhì)的指標(biāo)密切相關(guān)。肌內(nèi)脂肪的增加可能是由于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量增多引起的，也可能是由于單個脂肪細(xì)胞體積增大引起。通過探究肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖和分化過程，厘清山羊肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制，對完善山羊脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和通過分子生物學(xué)手段改善山羊肉品質(zhì)具有重要意義。
2、脂肪組織是動物機(jī)體儲藏與能量供應(yīng)的場所，在維持能量穩(wěn)態(tài)中扮演著重要作用。目前，大部分動物脂肪相關(guān)研究依然依賴于組織分離培養(yǎng)獲得的原代前體脂肪細(xì)胞。原代前體脂肪細(xì)胞直接由活體組織分離獲得，形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能更接近其在體內(nèi)的生活狀態(tài)，可以作為模型應(yīng)用于脂質(zhì)代謝相關(guān)研究。但是每個組織塊只能分離得到有限的原代前體脂肪細(xì)胞，且原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞不能無限傳代，因此在研究過程中需要重復(fù)的從組織中分離原代細(xì)胞，造成了原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在的難以克服的缺點和不足。具體如下：（1）分離周期長，分離成本高：每次分離山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞都需要屠宰0-3日的新生山羊，從采集山羊背最長肌到分離獲得可以使用的山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞最少需要一周的時間；（2）不同批次的細(xì)胞遺傳背景可能存在差
3、目前，聚焦在山羊肌內(nèi)脂肪的相關(guān)研究依然依賴于體外培養(yǎng)的原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞存在分離周期長、分離成本高和不同批次細(xì)胞難以獲得穩(wěn)定實驗結(jié)果等不足，而迄今還沒有建立永生化山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，極大的制約了山羊肌內(nèi)脂肪沉積的研究速度和研究深度。因此，建立單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系將有助于厘清山羊肌內(nèi)脂肪的調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)山羊肉質(zhì)改良的動物遺傳育種工作，推動肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)公開了一種單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系、制備方法及應(yīng)用，以解決相關(guān)技術(shù)中原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)過程中，存在分離周期長、分離成本高和不同批次細(xì)胞難以獲得穩(wěn)定實驗結(jié)果的技術(shù)問題。
2、為了解決上述問題，本專利技術(shù)采用下述技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)的第一個方面提供了一種單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法。
4、本專利技術(shù)單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟：
5、步驟s100：取山羊背最長肌，分離培養(yǎng)以獲得原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞；
6、步驟s200：將攜帶sv40-t的慢病毒感染原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，并添加嘌呤霉素篩選出感染攜帶sv40-t的慢病毒的陽性細(xì)胞，sv40-t的序列信息見seq.?1；
7、步驟s300：使用有限稀釋法，將篩選出的陽性細(xì)胞按照每孔一個細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)后，獲得單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞株；
8、步驟s400：挑選細(xì)胞融合密度達(dá)90%及以上的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系。
9、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.5?μg/ml。
10、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.0?μg/ml。
11、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為1.0?μg/ml。
12、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s200中，向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入攜帶sv40-t的慢病毒時，還向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入助轉(zhuǎn)劑，并且所述助轉(zhuǎn)劑為聚凝胺，聚凝胺的添加濃度為10?μg/ml。
13、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s100中，取山羊背最長肌，分離培養(yǎng)以獲得原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，包括如下步驟：
14、步驟s110：無菌條件下采集山羊背最長肌，使用pbs清洗后剪碎；
15、步驟s120：加入2倍體積的ⅱ型膠原酶，并于37?℃水浴鍋中消化1.5?h；
16、步驟s130：加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，過濾去除未消化的組織；
17、步驟s140：將濾液過篩，離心后棄上清液，收集細(xì)胞；
18、步驟s150：加入紅細(xì)胞裂解液，靜置、離心后棄上清液；
19、步驟s160：加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。
20、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s200中，將攜帶sv40-t的慢病毒感染原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，并添加嘌呤霉素篩選出感染攜帶sv40-t的慢病毒的陽性細(xì)胞，包括如下步驟：
21、將原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞融合密度到達(dá)70~80%時，加入攜帶sv40-t的慢病毒和10?μg/ml的助轉(zhuǎn)劑聚凝胺，感染48?h后添加1.0?μg/ml的嘌呤霉素，篩選出感染攜帶sv40-t的慢病毒的陽性細(xì)胞。
22、根據(jù)一個可選的實施方式，步驟s300中，培養(yǎng)篩選出的陽性細(xì)胞時，每2?d更換一次培養(yǎng)基。
23、本專利技術(shù)的第二方面提供了采用本專利技術(shù)中任一項技術(shù)方案所述的制備方法獲得的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系。
24、本專利技術(shù)的第三方面提供了本專利技術(shù)中任一項技術(shù)方案所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系在制備山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞模型中的應(yīng)用，所述模型用于山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖、分化聚脂和/或調(diào)控機(jī)理研究。
25、本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案能夠達(dá)到以下有益效果：
26、本專利技術(shù)提供的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，可獲得單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系。相比于原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，本專利技術(shù)獲得的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系在確保山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞形態(tài)和功能的同時，顯著增加了細(xì)胞的傳代代數(shù)，而且不需要重復(fù)采樣分離細(xì)胞，由于是單克隆細(xì)胞株獲得永生細(xì)胞系，既保證了細(xì)胞具有相同的遺傳背景，增強(qiáng)實驗的可重復(fù)性，還極大的節(jié)約了成本和工作量，可以作為山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖、分化聚脂和調(diào)控機(jī)理等研究的理想模型。
27、即本專利技術(shù)的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系，解決了相關(guān)技術(shù)中原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)過程中，存在分離周期長、分離成本高和不同批次細(xì)胞難以獲得穩(wěn)定實驗結(jié)果的技術(shù)問題。
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1.一種單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.5?μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.0?μg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S200中，添加嘌呤霉素的濃度為1.0?μg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S200中，向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入攜帶SV40-T的慢病毒時，還向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入助轉(zhuǎn)劑，并且所述助轉(zhuǎn)劑為聚凝胺，聚凝胺的添加濃度為10?μg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S100中，取山羊背最長肌，分離
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S200中，將攜帶SV40-T的慢病毒感染原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，并添加嘌呤霉素篩選出感染攜帶SV40-T的慢病毒的陽性細(xì)胞，包括如下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟S300中，培養(yǎng)篩選出的陽性細(xì)胞時，每2?d更換一次培養(yǎng)基。
9.一種采用權(quán)利要求1至8中任一項所述的制備方法獲得的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求9所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系在制備山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞模型中的應(yīng)用，其特征在于，所述模型用于山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖、分化聚脂和/或調(diào)控機(jī)理研究。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.5?μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為0.5~1.0?μg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟s200中，添加嘌呤霉素的濃度為1.0?μg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞永生化細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，步驟s200中，向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入攜帶sv40-t的慢病毒時，還向原代山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中加入助轉(zhuǎn)劑，并且所述助轉(zhuǎn)劑為聚凝胺，聚凝胺的添加濃度為10?μg/ml。
6.根...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：向華，王應(yīng)歸，黃煉，朱江江，石恒波，王永，林亞秋，張倡琿，杜站宇，
申請(專利權(quán))人：西南民族大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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