/p>3、傳統(tǒng)生產(chǎn)d-阿洛酮糖的主要方法包括化學(xué)法和生物法。bilik等研究發(fā)現(xiàn)在酸性水溶液中，d-果糖可以在鉬酸鹽離子的催化作用下轉(zhuǎn)化生成d-阿洛酮糖。1997年donald等將1,2:4,5-二-o-異亞丙基-β-d-吡喃果糖通過化學(xué)合成法制備d-阿洛酮糖。此外將乙醇和三乙胺煮沸也可合成d-阿洛酮糖。隨著深入的研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成存在著純化步驟較復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生化學(xué)廢料和無價(jià)值副產(chǎn)物等問題，同時(shí)化學(xué)合成甜味劑甜味往往不夠純正，因此應(yīng)用并不廣泛。
4、生物合成法利用自然界中大量存在的天然原料，以生物酶為催化劑制備阿洛酮糖，不僅有利于降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，而且符合當(dāng)下綠色環(huán)保的生產(chǎn)原則。目前主要方法是以酶作為催化劑的生物轉(zhuǎn)化法，以異構(gòu)酶為例，已經(jīng)鑒定的野生型酶的熱穩(wěn)定性普遍較低，為滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求，不同屬性的異構(gòu)酶的定向挖掘與熱穩(wěn)定性分析、改造開始被廣泛研究；同時(shí)在使用過程中，酶的保存是極為重要的一環(huán)，能夠延長酶的儲(chǔ)存壽命并保持穩(wěn)定性是將其投入商業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并表征的可用于d-阿洛酮糖生物法合成的生物催化劑有d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(d-psicose3-epimerase，dpease)和d-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶，并且大多數(shù)情況選擇d-果糖通過這兩種酶催化轉(zhuǎn)化來制取d-阿洛酮糖。
5、脂肪酸是價(jià)格低廉、易于獲得的綠色有機(jī)原料，其能量密度高于葡萄糖(d-葡萄糖)等原料，還可為生物合成提供更多還原力，從而提高生物制造的轉(zhuǎn)化率，是生物制造的理想原料之一，可以從油料粗加工產(chǎn)物、餐廚廢棄油等來源以低廉的價(jià)格獲取。而甘油和乙酸作為化工產(chǎn)品的副產(chǎn)物來源廣泛、價(jià)格低廉，以甘油或乙酸作為碳源發(fā)酵培養(yǎng)菌株有利于解決與人爭糧的問題。葡萄糖作為工業(yè)生產(chǎn)果糖的原料，比果糖成本更低。建立以甘油、乙酸、脂肪酸等為原料供微生物生長，以葡萄糖為原料合成d-阿洛酮糖的路線，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本申請(qǐng)要解決的技術(shù)問題是：如何實(shí)現(xiàn)利用甘油、乙酸、脂肪酸等原料供應(yīng)微生物生長并以d-葡萄糖為原料制備d-阿洛酮糖。
2、本申請(qǐng)?zhí)峁┲亟M大腸桿菌，所述重組大腸桿菌具有包括下述特征：
3、a1)、含有葡萄糖異構(gòu)酶基因和/或調(diào)控葡萄糖異構(gòu)酶基因表達(dá)的物質(zhì)；
4、a2)、含有己酮糖激酶基因和/或調(diào)控己酮糖激酶基因表達(dá)的物質(zhì)；
5、a3)、含有udp-葡萄糖焦磷酸化酶基因和/或調(diào)控udp-葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)的物質(zhì)；
6、a4)、含有ndp-己糖-3-差向異構(gòu)酶基因和/或調(diào)控ndp-己糖-3-差向異構(gòu)酶基因基因表達(dá)的物質(zhì)；
7、a5)、含有ndp糖水解酶基因和/或調(diào)控ndp糖水解酶基因表達(dá)的物質(zhì)；
8、a6)、含有降低葡萄糖激酶基因的表達(dá)和/或降低葡萄糖激酶活性或含量的物質(zhì)；
9、a7)、含有增強(qiáng)核苷二磷酸激酶基因表達(dá)和/或增強(qiáng)核苷二磷酸激酶活性或含量的物質(zhì)；
10、a8)、含有增強(qiáng)尿苷酸激酶基因表達(dá)和/或增強(qiáng)尿苷酸激酶基因活性或含量的物質(zhì)；
11、a9)、含有增強(qiáng)尿苷激酶基因表達(dá)和/或增強(qiáng)尿苷激酶活性或含量的物質(zhì)；
12、a10)、含有增強(qiáng)無機(jī)焦磷酸酶基因表達(dá)和/或增強(qiáng)無機(jī)焦磷酸酶活性或含量的物質(zhì)；
13、a11)、含有酸性磷酸酶基因和/或調(diào)控酸性磷酸酶基因表達(dá)的物質(zhì)；
14、a12)、含有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子基因和/或調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子基因表達(dá)的物質(zhì)；
15、a13)、不含有磷酸糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)g亞基基因；
16、a14)、不含有半乳糖阻遏因子基因；
17、a15)、不含有6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因；
18、a16)、不含有類脂a生物合成肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶基因。
19、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a1)-a5)中所述的物質(zhì)可為啟動(dòng)子。
20、進(jìn)一步地，a1)-a5)中所述的物質(zhì)可為啟動(dòng)子trc?promoter。所述啟動(dòng)子trcpromoter的核苷酸序列為seq?id?no.7第193-266位。
21、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a6)中所述的物質(zhì)在所述受體菌的葡萄糖激酶基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)引入。
22、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a6)中所述的物質(zhì)可為組成型弱啟動(dòng)子p113。
23、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a7)-a10)中所述的物質(zhì)分別在所述受體菌的核苷二磷酸激酶基因、增強(qiáng)尿苷酸激酶基因、尿苷激酶基因或無機(jī)焦磷酸酶基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)引入。
24、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a11)-a12)中所述的物質(zhì)分別與所述酸性磷酸酶基因或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子基因組成表達(dá)盒導(dǎo)入受體菌。
25、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，所述酸性磷酸酶基因和/或調(diào)控酸性磷酸酶基因表達(dá)的物質(zhì)的導(dǎo)入位點(diǎn)為所述受體菌的磷酸糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)g亞基基因位點(diǎn)。
26、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，所述葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子基因和/或調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子基因表達(dá)的物質(zhì)的導(dǎo)入位點(diǎn)為所述受體菌的半乳糖阻遏因子基因位點(diǎn)。
27、進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌中，a7)-a12)中所述的物質(zhì)可為組成型啟動(dòng)子pcpa1。
28、進(jìn)一步地，所述重組大腸桿菌還具有下述特征：...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌具有包括下述特征：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌還具有下述特征：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌還具有下述特征：
4.制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于：所述方法還包括下述步驟：
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述方法制備獲得的重組大腸桿菌。
8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌、權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的方法和/或權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌在C1)或C2)中的應(yīng)用，
9.一種組合物，其特征在于：所述組合物為D1)或D2)，
10.一種制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述方法包括使用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌、權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌和/或權(quán)利要求9所述的組合物以D-葡萄糖為底物制備D-阿洛酮糖。
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