【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體地說，是一種糖苷水解酶scbglu及其編碼基因和應用。
技術介紹
1、靛藍，作為一種古老且重要的工業色素，在紡織、食品、化妝品以及醫藥等多個領域具有廣泛的應用。靛藍的生產主要依賴于從植物如馬藍中提取的吲哚苷經過酶催化或化學氧化等步驟轉化而來。然而，傳統的提取和轉化方法效率低下，難以滿足現代工業對靛藍產量的需求。因此，研究和開發高效的靛藍生產方法成為了當前的熱點和難點。
2、馬藍，作為一種富含吲哚苷等糖苷類化合物的植物，是靛藍生產的重要原料。吲哚苷在特定的酶催化作用下，可以轉化為靛藍。因此，研究和開發針對馬藍糖苷的高效水解酶，對于提高靛藍的產量和效率具有重要意義。
3、糖苷水解酶是一類能夠特異性水解糖苷鍵的酶類，在植物資源的開發利用中扮演著重要角色。近年來，隨著生物技術的快速發展，糖苷水解酶的研究和應用取得了顯著進展。然而，針對馬藍糖苷的高效水解酶的研究相對較少，且現有的水解酶在催化效率、穩定性等方面存在不足，難以滿足靛藍生產的需求。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于針對現有的糖苷水解酶催化效率低、使用成本高等問題，提供一種糖苷水解酶scbglu及其編碼基因的克隆表達與應用，包括擴增獲得糖苷水解酶scbglu基因序列全長、重組表達載體pet-28a(+)-scbglu、重組菌，通過對蛋白誘導表達，純化等方法獲得糖苷水解酶scbglu的過程。
2、本專利技術的第一方面，提供一種糖苷水解酶scbglu的編碼基因，其
3、本專利技術的第二方面，提供一種糖苷水解酶scbglu，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4、以新鮮馬藍葉子中獲得的cdna為模板，設計特異性引物bglu-f和bglu-r，構建質粒bluntzero-scbglu，于top10感受態中進行質粒擴增，并進行測序，即本專利技術的糖苷水解酶scbglu。
5、本專利技術的第三方面，提供一種重組表達載體，所述的重組表達載體中含有糖苷水解酶scbglu的編碼基因seq?id?no.1。
6、本專利技術的第四方面，提供一種重組菌，所述的重組菌中含有糖苷水解酶scbglu的編碼基因seq?id?no.1。
7、進一步地，所述的重組菌是將如上所述的重組表達載體轉化宿主細胞構成重組菌。
8、進一步地，在制備所述的重組表達載體或重組菌時，用于擴增糖苷水解酶scbglu的編碼基因所用引物如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示：
9、bglu-f：5’-atggcgatgaccacgagc-3’(seq?id?no.3)
10、bglu-r：5’-tcatgttgctcttgatcttttccc-3’(seq?id?no.4)。
11、本專利技術的第五方面，提供一種糖苷水解酶scbglu的制備方法，包括如上所述的重組表達載體pet-28a(+)-scbglu、重組菌，通過對蛋白誘導表達，純化等方法獲得糖苷水解酶scbglu的步驟。
12、進一步地，具體包括以下步驟：
13、(a)將seq?id?no.1所示的核苷酸序列進行pcr擴增；
14、(b)構建重組質粒pet-28a(+)-scbglu；
15、(c)將重組質粒pet-28a(+)-scbglu導入大腸桿菌rosetta(de3)，命名為重組菌；
16、(d)挑選重組菌的單克隆培養，然后擴大培養，搖床過夜培養后，加入誘導劑進行誘導培養，收集菌液，離心后，收集沉淀；
17、(e)向沉淀中加入緩沖液重懸菌株，再超聲裂解后，離心，收集上清后冷凍備用。
18、(f)利用鎳柱對步驟e中的上清進行分級純化，50mm-300mm咪唑/tri-hcl溶液進行洗脫，最終獲得純化后的蛋白，即得。
19、本專利技術的第六方面，提供一種如上所述的糖苷水解酶scbglu、其編碼基因、重組表達載體、重組菌在靛藍生產中的應用。
20、本專利技術的第七方面，提供一種靛藍的制備方法，是采用如上所述的糖苷水解酶scbglu催化吲哚苷產生靛藍。
21、本專利技術優點在于：
22、1、本專利技術的糖苷水解酶scbglu的基因來自馬藍葉片，核苷酸序列如seq?id?no.1所示，氨基酸系列如seq?id?no.2所示。將該酶的基因進行克隆、并以pet-28a(+)作為表達質粒，大腸桿菌escherichia?coli?rosetta(de3)作為表達宿主，構建重組菌株、進行糖苷水解酶scbglu基因的蛋白表達，his-tag純化后鑒定重組蛋白具有糖苷水解酶的性質。
23、2、本專利技術的糖苷水解酶scbglu具有較高的熱穩定性和ph值穩定性，其最適溫度為55℃，最適ph為8.0。對于反應底物具有一定的選擇性，能識別β-糖苷鍵，不能識別α-糖苷鍵。
24、3、本專利技術為高效的生物合成色素靛藍奠定基礎，在食品工業和農業中的應用潛力巨大。
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1.一種糖苷水解酶ScBGLU的編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
2.一種糖苷水解酶ScBGLU，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
3.一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體中含有糖苷水解酶ScBGLU的編碼基因SEQ?ID?No.1。
4.一種重組菌，其特征在于，所述的重組菌中含有糖苷水解酶ScBGLU的編碼基因SEQID?No.1。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于，所述的重組菌是將權利要求3所述的重組表達載體轉化宿主細胞構成重組菌。
6.用于擴增糖苷水解酶ScBGLU的編碼基因的引物，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。
7.一種糖苷水解酶ScBGLU的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括權利要求3所述的重組表達載體、權利要求4所述的重組菌，通過對蛋白誘導表達，純化方法獲得糖苷水解酶ScBGLU的步驟。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.權利要求1所述的糖苷水解酶ScBGLU的編碼基因、權利要求2所述的糖苷水解酶ScBGLU、權利要求3所述的重組表達載體、權利要求4所述的重組菌在靛藍生產中的應用。
10.一種靛藍的制備方法，其特征在于，是采用權利要求2所述的糖苷水解酶ScBGLU催化吲哚苷產生靛藍。
...【技術特征摘要】
1.一種糖苷水解酶scbglu的編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種糖苷水解酶scbglu，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3.一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體中含有糖苷水解酶scbglu的編碼基因seq?id?no.1。
4.一種重組菌，其特征在于，所述的重組菌中含有糖苷水解酶scbglu的編碼基因seqid?no.1。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于，所述的重組菌是將權利要求3所述的重組表達載體轉化宿主細胞構成重組菌。
6.用于擴增糖苷水解酶scbglu的編碼基因的引物，其特征在于，所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚何新，劉暢，程夢雅，黃玉香，張丹鳳，
申請(專利權)人：中國人民解放軍海軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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