【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥，具體的涉及用于一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠及其制備方法與應用。
技術介紹
1、關節軟骨(ac)損傷是臨床上常見的一種骨科疾病，由于關節軟骨缺乏血管、神經和淋巴管，導致其損傷后自愈能力有限。目前，軟骨移植修復是關節軟骨修復的治療方法之一。組織工程為軟骨缺損修復提供了新的思路，細胞、生長因子、支架材料作為軟骨組織工程的三大要素在軟骨再生過程中起著重要作用。
2、目前對于關節軟骨的研究多采用ⅰ型或ⅱ型膠原殼聚糖等支架進行軟骨缺損修復，由于采用膠原殼聚糖可能會導致軟骨骨化，不利于軟骨組織修復。如中國專利cn101020083a公開了一種具有仿生功能界面骨軟骨復合組織一體化工程支架，其中，采用ii型膠原和殼聚糖制備軟骨復合組織，但是該方法制備得的是多層的骨-軟骨復合支架，并不適用于間充質干細胞的粘附生長以及后期的增殖分化等。因此，急需開發一種能夠適用于軟骨修復的，能和細胞共同培養，具有優良力學性能、孔隙率的軟骨支架，能應用于組織工程軟骨的研究中，為軟骨缺損治療提供更優的選擇。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，所述的復合水凝膠可促進細胞發生聚集，利于提高細胞的存活和軟骨分化，從而促進軟骨修復。
2、具體的，本專利技術提供了一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，所述復合水凝膠通過甲基丙烯酸殼聚糖、甲基丙烯酸改性脫細胞基質進行交聯制備得到；其中，所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比
3、在一些實施方案中，所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:3-5。優選的，所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:5。
4、在一些實施方案中，所述甲基丙烯酸殼聚糖的濃度為2%?(m/v)，所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的濃度為1-5%?(m/v)。優選的，所述甲基丙烯酸殼聚糖的濃度為2%?(m/v)，所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的濃度為3-5%?(m/v)。更優選的，所述甲基丙烯酸殼聚糖的濃度為2%?(m/v)，所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的濃度為5%?(m/v)。
5、另一方面，本專利技術提供了上述基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將甲基丙烯酸殼聚糖和甲基丙烯酸改性脫細胞基質溶解在去離子水中，加入光引發劑，紫外線照射進行交聯反應，得到復合水凝膠。
6、在一些實施方案中，所述光引發劑為苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰。
7、在一些實施方案中，紫外線照射的時間為1-3min。
8、在一些實施方案中，所述甲基丙烯酸殼聚糖的制備方法包括以下步驟：將殼聚糖溶解在溶液中，滴入甲基丙烯酸酐，在60℃-80℃下攪拌2-5h反應，用堿液調ph至中性，然后將混合溶液在60℃-80℃下攪拌20-30h，所得產物透析，凍干得甲基丙烯酸殼聚糖。
9、在一些實施方案中，所述殼聚糖與所述甲基丙烯酸酐的質量體積（g/ml）比為2-5:5-10，優選的，質量體積比為3:8。
10、在一些實施方案中，所述甲基丙烯酸殼聚糖的制備方法包括以下步驟：將殼聚糖溶解在乙酸中，滴入甲基丙烯酸酐，在60℃-70℃下攪拌3h反應，用碳酸氫鈉溶液調ph至中性，然后將混合溶液在60℃-70℃下攪拌24h，所得產物透析，凍干得甲基丙烯酸殼聚糖。
11、在一些實施方案中，所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的制備過程包括以下步驟：將脫細胞基質溶解于去離子水中，加入甲基丙烯酸酐，調節ph為8.0-9.0，在4℃條件下反應20-30h，所得產物透析，凍干，得甲基丙烯酸改性脫細胞基質。
12、在一些實施方案中，所述脫細胞基質的制備過程包括以下步驟：
13、a)取軟骨切成小塊，循環凍融后，浸泡于1%過氧化氫中處理1-2h，pbs溶液沖洗，置于去離子水中冷凍；
14、b)浸泡于0.4%-0.8%胰蛋白酶中，37℃孵育2-3分鐘，終止消化；
15、c)將步驟b)制備的樣品依次置于pbs溶液、5%-8%?triton?x-100溶液、5%-8%脫氧膽酸鈉溶液、2%-4%?triton?x-100溶液和pbs溶液中，每種溶液4oc恒溫震蕩24-36h，每種溶液處理后用pbs洗滌，冷凍干燥；
16、d)將所述脫細胞基質再次粉碎，用消化液消化，然后用堿液和10×pbs中和反應粘性溶液，之后透析，凍干制備得到脫細胞基質。
17、在一些實施方案中，步驟a)中，所述循環凍融的過程包括：取軟骨切塊后，置于去離子水中，冰凍，復融；再置于10%nacl溶液中，冰凍，復融。
18、在一些實施方案中，步驟a)中，所述循環凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復融；再置于10%nacl溶液中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復融。
19、在一些實施方案中，步驟b)中，加入bsa終止消化。
20、在一些實施方案中，步驟b)中，所述胰蛋白酶的濃度為5%。
21、在一些實施方案中，步驟c)中，將步驟b)制備的樣品依次置于pbs溶液、5%?tritonx-100溶液、6%脫氧膽酸鈉溶液、3%?triton?x-100溶液和pbs溶液中，4oc下分別攪拌36?h、24?h、24?h、24?h、24?h，每種溶液處理后用pbs洗滌，冷凍干燥。
22、在一些實施方案中，步驟d）中，所述消化液為含有胃蛋白酶的hcl水溶液。
23、在一些實施方案中，步驟d)中，所述脫細胞基質細粉與胃蛋白酶的質量比為5~20:1。優選的，質量比為10:?1。
24、在一些實施方案中，步驟d)中，將所述脫細胞基質細粉粉碎，置于含有胃蛋白酶的0.01m?hcl水溶液中，在室溫下攪拌72小時，用naoh水溶液和10×pbs中和反應粘性溶液，透析，冷凍干燥，制備得到脫細胞基質。
25、本專利技術首先進行脫細胞外基質處理，采用循環凍融的方式更充分裂解細胞，與未凍融相比，制備得的脫細胞半月板中的糖胺聚糖成分保留更好。經1%過氧化氫中處理，可以有效地破壞細胞膜的通透性。之后將樣品依次置于pbs溶液、triton?x-100溶液、脫氧膽酸鈉溶液、triton?x-100溶液和pbs溶液中次進行處理，與未處理相比，有效地去除了細胞碎片和細胞核成分，增加了組織的孔隙度。通過上述方法獲得的脫細胞外基質免疫原性成分清除率高，且保留了大量的膠原蛋白和gag，具有良好的生物活性。進一步制備成的水凝膠微孔內存在納米纖維結構，為細胞提供了粘附位點，有利于細胞穩定粘附和增殖，對于組織修復具有更好的促進作用。
26、另一方面，本專利技術還提供上述基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠在制備用于制作軟骨修復材料中的應用。
27、在一些實施方案中，所述軟骨修復材料為軟骨修復支架。...
【技術保護點】
1.一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述復合水凝膠通過甲基丙烯酸殼聚糖、甲基丙烯酸改性脫細胞基質進行交聯制備得到；其中，所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:1-5。
2.根據權利要求1所述的所述一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:3-5。
3.根據權利要求1所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述復合水凝膠制備方法包括以下步驟：將甲基丙烯酸殼聚糖和甲基丙烯酸改性脫細胞基質溶解在去離子水中，加入光引發劑，紫外線照射進行交聯反應，得到復合水凝膠。
4.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述光引發劑為苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰。
5.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：紫外線照射的時間為1-3min。
6.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述甲基丙烯酸殼
7.根據權利要求6所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述殼聚糖與所述甲基丙烯酸酐的質量體積（g/mL）比為2-5:5-10。
8.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的制備過程包括以下步驟：將脫細胞基質溶解于去離子水中，加入甲基丙烯酸酐，調節pH為8.0-9.0，在4℃條件下反應20-30h，所得產物透析，凍干，得甲基丙烯酸改性脫細胞基質。
9.如權利要求1-8中任一項所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠在制備用于制作軟骨修復材料中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述軟骨為關節軟骨。
...【技術特征摘要】
1.一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述復合水凝膠通過甲基丙烯酸殼聚糖、甲基丙烯酸改性脫細胞基質進行交聯制備得到；其中，所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:1-5。
2.根據權利要求1所述的所述一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述甲基丙烯酸殼聚糖與所述甲基丙烯酸改性脫細胞基質的質量比為：2:3-5。
3.根據權利要求1所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述復合水凝膠制備方法包括以下步驟：將甲基丙烯酸殼聚糖和甲基丙烯酸改性脫細胞基質溶解在去離子水中，加入光引發劑，紫外線照射進行交聯反應，得到復合水凝膠。
4.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：所述光引發劑為苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰。
5.根據權利要求3所述的一種基于殼聚糖和脫細胞基質的復合水凝膠，其特征在于：紫外線照射的時間為1-3min。
6.根據權利要求3所述的一種基...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柯春海，馮培培，賀超楠，馬靜云，
申請(專利權)人：寧波市醫療中心李惠利醫院寧波大學附屬李惠利醫院，
類型：發明
國別省市：
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