【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程領域，具體涉及一種巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法。
技術介紹
1、巖原鯉，分布于長江上游及其支流，是一種棲息于長江流域底層石縫間的底層魚類，以嘉陵江、岷江和金沙江居多，現為四川、重慶等地的野生名貴經濟魚類之一。巖原鯉經濟價值和營養價值很高，但由于巖原鯉初次性成熟時間較長、人工繁育不成熟、生長較慢以及屬于異源四倍體可能編輯效率會很低等原因未能很好的推廣市場，并且目前對于巖原鯉的研究很少，幾乎僅限于中文文獻中關于飼料營養的研究，這極大阻礙了其遺傳種質資源開發和經濟性狀挖掘的需要。因此在巖原鯉上開發基因編輯方法來創制新品種以及縮短繁殖周期具有重要意義。巖原鯉作為新研究對象且具有重要營養和經濟價值，但卻由于自身性狀原因不能很好推廣，而crispr/cas9基因編輯就提供了一個手段方法，且巖原鯉作為異源四倍體，利用基因編輯來開展精準育種和創制新品種是一個突破和創新。因此該技術既可以用于研究巖原鯉基因的功能，又可以用于精準修飾編輯巖原鯉內源靶基因，培育遺傳改良的巖原鯉養殖新品系，也對其它異源四倍體的魚類研究提供參考價值。
技術實現思路
1、針對現有技術的上述不足，本專利技術提供了一種巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，能對巖原鯉生長、性別等相關重要基因進行編輯的技術，從而創制具有生長快、肉質多或肌間刺少等優良品種，且也可以用于對巖原鯉基因功能的研究。
2、為達到上述專利技術目的，本專利技術所采用的技術方案為：
3、提供一種巖原鯉
4、s1：根據目的基因設計、轉錄得到目的基因對應的sgrna；
5、s2：將sgrna和cas9蛋白混合后通過顯微注射至巖原鯉的受精卵中；
6、s3：將注射有sgrna和cas9蛋白的受精卵進行培養，完成目的基因編輯。
7、進一步的，步驟s1中對sgrna靶位點的設計要求具體為：
8、sgrna靶位點在atg設計靶位點的外顯子序列內進行選擇，長度為20bp；且gc含量在70％-85％。
9、進一步的，巖原鯉的受精卵的獲取方法具體為：
10、a1：挑選4-5月份繁殖季節健康、性成熟的雌雄巖原鯉；
11、a2：對雌雄巖原鯉均進行催產激素的注射；
12、a3：注射完成，水溫25℃下雌雄巖原鯉分別養殖10h后，分別擠出精液和卵子，加入少量水混合攪拌；
13、a4：持續攪拌2min后，洗去多余的精液得到受精卵，保存備用。
14、進一步的，催產激素為混合激素，包含hcg激素、dom激素和lrh-a2激素。
15、進一步的，步驟a2具體方法為：向巖原鯉腹鰭下注射一次催產激素后，在水溫25℃下將雌雄巖原鯉分別養殖10h后，再次注射一次催產激素，執行步驟a3。
16、進一步的，步驟a4中，對受精卵保存時，將受精卵保存在平衡液中，平衡液包括0.7～0.9％的氯化鈉、0.01～0.05％的氯化鉀和0.01～0.04％的氯化鈣。
17、進一步的，步驟s2中，對受精卵進行注射時，sgrna濃度為500ng/ul，cas9蛋白濃度為450ng/ul，將sgrna和cas9蛋白以1:1的體積比混合后，向每個受精卵注射3nl的混合液。
18、進一步的，注射sgrna和cas9蛋白時，受精卵放置在墊有紗布的培養皿中進行，且紗布為40目。
19、進一步的，受精卵注射sgrna和cas9蛋白后，將紗布提起放入網箱中，待受精卵慢慢散開后再將網紗取出，用羽毛輕輕將受精卵分散在網箱中，保持網箱中25度、充氧加流水的環境培育。
20、本專利技術的有益效果為：
21、1、本專利技術首次在異源四倍體魚類中使用基因編輯，建立起了從基因序列篩選、sgrna/cas9顯微注射到表型驗證的巖原鯉crispr/cas9基因編輯全流程技術平臺，這也為深入研究巖原鯉這個新物種提供了材料，打破針對巖原鯉僅能進行基礎的表面遺傳學研究、難以深入遺傳功能驗證的局面。
22、2、制作了適合粘性卵顯微注射的模具，使用了最適sgrna濃度提高編輯胚胎成活率，關注到了受精卵會吸水導致不容易注射這個現象，使用平衡液解決了該問題，同時還進一步提高了成活率。
23、3、流程化、可控的在胚胎分裂為2-細胞期之前完成顯微注射；人工受精后能在確定時間開始受精，避免卵子超熟和精液損失。
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1.一種巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟S1中對sgRNA靶位點的設計要求具體為：
3.根據權利要求1所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述巖原鯉的受精卵的獲取方法具體為：
4.根據權利要求2所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述催產激素為混合激素，包含HCG激素、DOM激素和LRH-A2激素。
5.根據權利要求2所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟A2具體方法為：向巖原鯉腹鰭下注射一次催產激素后，在水溫25℃下將雌雄巖原鯉分別養殖10h后，再次注射一次催產激素，執行步驟A3。
6.根據權利要求2所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟A4中，對受精卵保存時，將受精卵保存在平衡液中，所述平衡液包括0.7～0.9％的氯化鈉、0.01～0.05％的氯化鉀和0.01～0.04％的氯化
7.根據權利要求1所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟S2中，對受精卵進行注射時，sgRNA濃度為500ng/ul，Cas9蛋白濃度為450ng/ul，將sgRNA和Cas9蛋白以1:1的體積比混合后，向每個受精卵注射3nl的混合液。
8.根據權利要求1所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，注射sgRNA和Cas9蛋白時，受精卵放置在墊有紗布的培養皿中進行，且紗布為40目。
9.根據權利要求8所述的巖原鯉的CRISPR/Cas9基因編輯方法，其特征在于，受精卵注射sgRNA和Cas9蛋白后，將紗布提起放入網箱中，待受精卵慢慢散開后再將網紗取出，用羽毛輕輕將受精卵分散在網箱中，保持網箱中25度、充氧加流水的環境培育。
...【技術特征摘要】
1.一種巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟s1中對sgrna靶位點的設計要求具體為：
3.根據權利要求1所述的巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，所述巖原鯉的受精卵的獲取方法具體為：
4.根據權利要求2所述的巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，所述催產激素為混合激素，包含hcg激素、dom激素和lrh-a2激素。
5.根據權利要求2所述的巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟a2具體方法為：向巖原鯉腹鰭下注射一次催產激素后，在水溫25℃下將雌雄巖原鯉分別養殖10h后，再次注射一次催產激素，執行步驟a3。
6.根據權利要求2所述的巖原鯉的crispr/cas9基因編輯方法，其特征在于，所述步驟a4中，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：代向燕，彭麗，王志堅，周劍，李寧，彭琳益，
申請(專利權)人：西部重慶科學城種質創制大科學中心，
類型：發明
國別省市：
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